唾液蛋白质组生物标记物的分析，用于监测儿童早期龋齿高危状态的变化

背景

儿童早期龋齿是一个紧迫的公共卫生问题。本研究的目的是调查唾液腺蛋白质组生物标记物，以监测儿童早期龋齿高危状态的变化。该过程包括筛选特定的唾液肽，这些肽仅在个体龋病状态的动态变化下才有差异表达。

方法

采集北京市28名3 - 4岁幼儿园儿童的全唾液刺激样本，分别于基线时、基线后3个月和6个月采集。共收集68份样本。根据观察期间龋病状况及进展情况，将受试者分为3组;非龋病复发组7例，龋病复发组6例，健康对照组15例。采用磁珠结合基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，筛选出在不同龋病状态组间横断面比较无显著差异，仅随个体龋病动态变化而有差异的唾液肽。采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)技术鉴定多肽来源的蛋白质。

结果

在上述比较中，我们发现两种唾液肽仅在个体龋病状态动态变化下才有差异表达;质荷比(米/z)的含量分别为1045.9和2517.6 (P< 0.05)。基于这两种多肽的主成分分析(PCA)和决策树模型对儿童早期龋齿高危状态的变化具有可接受的区分能力。这两个多肽的源蛋白具有米/z分别为1045.9和2517.6，分别为颌下腺雄激素调节蛋白3B (SMR-3B)和黏液素-7。

结论

儿童唾液中的两种蛋白质，即SMR-3B和粘蛋白-7，有可能作为儿童早期龋齿高危状态变化动态监测的候选生物标志物。

儿童早期龋齿是儿童最常见的慢性疾病之一，影响着全球6亿多儿童的口腔健康状况，对全球公共卫生领域构成重大挑战[1］．第四次全国口腔流行病学调查显示，5岁儿童龋齿患病率为71.9%，较前几次调查呈快速增长趋势，其中75.4%的龋齿集中在三分之一[2］．儿童龋齿具有发病早、进展快、危害大的特点。这是继承恒齿龋病的主要危险因素之一[3.］．影响儿童龋齿的因素有很多，包括口腔卫生习惯、饮食习惯和家庭环境[4］．此外，儿童在治疗后患龋齿的风险可能更高[5，6］．未经治疗的龋齿对儿童的咀嚼、发音和生长有显著影响。当儿童蛀牙严重，最终给家庭和社会造成相当大的负担时，可在特定情况下使用全麻[7，8］．预防和早期治疗龋齿是保持儿童口腔和全身健康的重要保证。应优先考虑及早筛检高危人群及及时采取有针对性的措施，以预防或减少龋齿的发生。

早期龋齿风险评估是减少与晚期龋齿进展相关的危害的关键过程。目前，基于唾液腺蛋白、微生物和生化因素的龋病评估模型[9，10，11]，以及牙釉质的微观结构和基因水平[12，13]，显示出良好的评估儿童龋齿风险的能力。通过对高危人群龋齿的有效筛查，个性化龋齿风险评估模型可为口腔公共卫生和健康教育的制定提供理论依据，促进口腔卫生保健资源的合理配置。

唾液中的多种蛋白质和多肽在维持和调节口腔环境稳态方面起着重要作用，可用于监测口腔健康和疾病状态的动态变化。有研究表明，唾液腺蛋白可在牙齿表面形成保护屏障，形成防御系统，抑制脱矿，吸引钙磷离子沉积，促进牙釉质再矿化[14］．同时，唾液蛋白具有与微生物相互作用的能力，抑制致龋细菌聚集，维持口腔稳定[15］．由于唾液具有无创、快速、易于运输和储存的优点，已成为研究龋齿生物标志物的重要媒介。涎腺蛋白生物标志物作为预防儿童龋齿的关键，应用于早期筛查高危人群具有现实意义和研究价值。

目前，唾液生物标志物的研究多是通过比较特定龋病状态来报道差异表达的蛋白或肽，而很少有研究试图探索个体龋病状态的动态变化。因此，这些候选生物标志物的进一步应用尚存疑问。本研究研究的唾液蛋白和多肽在不同组间的横断面比较中没有显著差异，只是随着个体龋病状态的动态变化而有差异表达。这些潜在的生物标志物肯定有助于更准确和有效地监测儿童早期龋齿高危状态的变化。因此，可以对这些龋齿风险较高的人群实施更有效的预防和干预措施，接近未来以重点人群为重点的儿童早期龋齿综合防治的目标。

招募学员，口试及跟进

在本研究中，28名来自北京某幼儿园的3-4岁儿童在父母的知情同意下入园。该方案及相关材料经北京大学口腔医学院机构评审委员会(颁发号:pkussib -201735057)批准。所有程序都符合《赫尔辛基宣言》。

口腔检查由一位有经验的临床牙医完成，他自己的标准一致性测试显示Kappa值高于0.85。龋病诊断符合世界卫生组织关于龋病诊断标准的相关标准(5^th版,2013)。本研究中使用的龋齿诊断标准认为，在牙坑或牙裂或牙齿光滑表面的病变，破坏了牙釉质，突出的龋齿或软化的龋齿可以被视为龋齿。入选标准如下:(1)过去一个月内未患上呼吸道传染病或服用抗生素;(2)无全身性疾病;(3)无口腔疾病相关的黏膜疾病或颌面外科手术;(4)兼容采样和处理。在所有接受口腔检查的儿童中，只有28名儿童符合所有纳入标准，最终纳入本研究。

在6个月的随访期间，对所有受试者进行口腔卫生和饮食指导，随访后根据6个月来龋病状况和龋病进展情况分为以下3组:无龋复发组(C组)、龋复发组(CR组)和健康对照组(H组)。

唾液样本采集

本研究的采样时间点与口腔检查随访的采样时间点相同，包括基线(T0)、3个月(T1)、6个月(T2)。在每个时间点进行口腔检查和唾液采集，用指定的代码记录孩子在该时间点的龋齿状况(0，无龋齿或有龋齿经历;1、存在未经治疗的龋齿;2、有治疗史的龋齿;3、无龋且有治疗史;4、有无因龋齿而缺牙)。每当发现新的龋损，都在短时间内得到适当的治疗。从上午9:00到11:00采集受刺激的全唾液样本。儿童在采样前1小时内不要进食或喝水，并在采样前10分钟用清水漱口。总共3ml的刺激唾液样本(仅通过刷牙合面)被收集到一个5ml的试管中。 Each of the tubes was marked with a serial number and then immediately placed on ice. These saliva samples were sent to the laboratory within 4 h. Saliva samples were centrifuged at 10,000 rpm for 10 min at 4 °C. One millilitre of supernatant was transferred into a 1.5 ml EP tube and stored in a refrigerator at − 80 °C for further use.

用质谱技术对唾液样品的多肽检测

使用磁珠试剂盒(Bioyong Tech, Inc.， Beijing, China)分析唾液样本。用磁珠结合基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行进一步分析。具体程序参考Si [16和太阳[17］．三肽混合物(单同位素分子量为1533.8582、2465.1989和5730.6087 Da;用Sigma产品号P2613, A8346和I6279分别校准质谱仪。在MALDI程序中对每个样品进行三次重复分析，而后续的分析基于使用合并计算器程序(Bioyong Tech, Beijing, China)三次重复测量得到的每个样品的平均光谱。然后采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)对混合唾液样本进行分析。蛋白质组学分析软件Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Technology Co.， Waltham, MA, USA)用于识别目标肽的来源。

统计分析

使用BioExplorer 1.0软件(Bioyong Tech, Inc.)和SPSS 25.0软件(IBM, Chicago, USA)对这些肽进行单因素方差分析、卡方检验、Wilcoxon秩相关检验和Kruskal-Wallis非参数检验筛选，组间龋病状态横断面比较无显著差异，仅随个体龋病动态变化而表现差异。使用R Studio 1.4软件(R Studio software Company, Boston, MA, USA)结合R语言3.6.3版本包绘制主成分分析图。在这项研究中，P< 0.05为有统计学意义。

参与者的特点

本研究中三个组[无龋齿组(C组)、龋齿复发组(CR组)、健康对照组(H组)]的人口统计学情况见表1．在基线时，年龄(P= 0.205)和性别(P= 0.358)，各组间无显著差异。

两种多肽仅在龋病动态变化下差异表达

在研究过程中的每个时间点总共收集了68个唾液样本。利用MALDI-TOF MS技术比较不同龋病状态组间多肽表达的差异，我们发现37个多肽在不同龋病状态组间的横断面比较中均无显著差异。

根据龋病在各时间点的动态变化特征进一步进行组间多肽筛选。结果，两个多肽，其质量电荷比(m / z)分别为1045.9和2517.6。1，2，3.)，仅随个体龋病状态的动态变化而差异表达(P< 0.05)(图;1，2)．

差异表达肽的鉴定

根据LC-ESI-MS /MS结果，含有m/z1045.9为上颌骨腺雄激素调节蛋白3B (SMR-3B)片段，m/z2517.6被鉴定为来源于粘蛋白-7(表2)．

主成分分析显示三组患者的离散倾向

基于这两种多肽在三个时间点进行主成分分析(PCA)米/z值分别为1045.9和2517.6。结果表明，在基线(T0)时，三组患者的离散倾向较弱;C + CR组与H组在3个月时(T1)有明显的分离趋势。在6个月(T2)时，三组间细胞分布更加分散(图2)。4)．

建立决策树，区分高危龋状态的变化

根据肽峰强度的差异，建立决策树模型，筛选龋齿高危个体(图5)。5)．当肽与之配合米/z值为1045.9表示强度为634或更低的肽米/z值1045.9的强度大于634，但肽的强度米/z2517.6值为37或更低，说明个体可能属于龋病或龋病复发的高危人群，这可能有助于改变儿童早期龋病的高危状态。同时，含有m/的肽的个体z值为1045.9，强度高于634，肽的m/z数值为2517.6且强度大于37的人更有可能处于无龋齿状态。决策树模型对高危龋病状态变化的敏感度为84.5%。

儿童早期龋齿是一个重要的公共卫生问题[18］．中国最新的流行病学调查结果表明，3-5岁儿童乳牙龋患病率较高，且呈上升趋势，必将对这些年轻人群的身心健康和社会经济发展产生不可估量的影响。唾液是口腔健康的决定因素之一，唾液中的蛋白质和多肽等成分在维持口腔健康和牙齿完整性方面发挥着重要作用。个体间唾液蛋白的多样性与龋病有关。目前，尽早筛查龋齿高危人群，对于加强儿童龋齿综合防治，实施更加准确有效的预防和干预措施具有重要意义。蛋白质组学和肽组学技术的发展为龋病的动态监测开辟了新的领域，其高敏感性和特异性的优势为唾液生物标志物的探索提供了良好的理论基础。

龋病风险是指在规定的时间内，如果情况不变，龋病发生或发展的可能性[19］．一项为期2年的儿童随访发现，过去有龋齿是新病变的一个很大的危险因素(RR: 1.52, 95% CI 1.12-2.05) [20.］．一项包括712名北京儿童的前瞻性队列研究表明，有龋齿史是进一步发展龋齿的重要危险因素之一[21］．根据幼儿蛀牙的风险类别，六岁以下儿童出现牙质蛀牙即属高风险[22］．根据一些研究报告，37-54.2%的参与者在首次龋病治疗后6个月内发现复发龋病[23，24，25］．因此，本研究中C组和CR组龋病状况的变化可视为儿童早期龋病的高危人群。随访期为6个月，以监测儿童龋病的变化。为了在复发前检测龋病的预测生物标志物并减少新病变的发生率，本研究将随访期缩短至3个月。

既往文献证实唾液腺蛋白是评价儿童早期龋齿发展进展的有效指标。两个多肽米/z本研究筛选出的1045.9和2517.6在不同龋病状态组间的横截面比较和龋病状态动态变化中的差异表达均无显著差异，说明这两种多肽与儿童龋病高危状态的动态变化密切相关。以往的同类研究多为横断面比较研究[26，27]，未能反映生物标志物与疾病之间的因果关系，这在不同的研究人群中也显示出不同的趋势[28，29］．所有这些研究都表明，在考虑生物标志物时，有必要引入龋病状态的动态变化，以及筛选具有更好特异性的蛋白质和多肽来评估风险的变化。作为一项纵向设计、定期随访的研究，其优点是可以结合研究期间龋病的动态状态和唾液蛋白、多肽的不同表达，敏感、有效地确定生物标志物。本研究采用刺激唾液作为唾液样本采集方法，是对学龄前儿童唾液样本采集流程依从性较差的较好选择，目的是在较短的时间内更方便地采集到足量的唾液样本。根据我们的初步研究结果，最小干预刺激方法(仅在儿童咬合表面刷牙)不会显著干扰唾液肽穹的分析结果，并且已经在我们课组之前进行的一系列研究中使用[17，30.，31］．

本研究将状态分为五种类型:健康、龋齿未处理、补牙治疗后龋齿、补牙治疗后无龋齿、因龋齿而缺牙。在观察过程中，没有因龋齿而缺牙的个体，因此我们在本研究中主要考察了前四种龋齿状态之间的相互转化关系。根据龋病状况的变化，将受试者分为三组，基线时性别和年龄无显著差异。以往的研究表明，某些唾液蛋白和多肽在儿童不同的龋齿状态中有差异。孙等人[17]在s-ECC患者治疗前后的唾液中发现了7个肽，其中2个来自于组他蛋白-1。田等人。[30.]分析了治疗前、治疗10天和治疗4个月后的唾液，发现两种m/z值分别为3162.0和3290.4的多肽与s-ECC的复发有关。在龋病状态变化的类别方面，以往的研究常将受试者分为DMFT (DMFT)组或龋病进展组[32］．此外，一些研究人员根据国际龋齿检测和评估系统(ICDAS)对各种分类进行了改进。Guedes等人[33]根据牙釉质龋和牙本质龋对患者进行分类，发现儿童唾液中的8种唾液蛋白，包括碳酸酐酶1、白细胞介素-36和血清淀粉样蛋白，与龋的发生有关。到目前为止，考虑到龋病的治疗历史和复发经验，以及龋病状态的多样性的报道很少，这也是本研究的创新点。

对于本研究中发现的两个多肽(分别被鉴定为SMR-3B和mucin-7的片段)，在不同状态的组间没有检测到显著差异，但它们在个体转化中表达差异。SMR-3B是一种具有抗炎活性的蛋白，属于脂多糖结合蛋白Aggregatibacter actinomycetemcomitans而且Porphyromonas gingivalis.它具有通过干扰细菌粘附和定植来维持抗菌和免疫调节的能力[34，35］．在体外试验中答:actinomycetemcomitans对?的生长有抑制作用变形链球菌［36］．在龋齿状态的过程中，变异链球菌合成不溶于水的葡聚糖，降低牙齿局部的pH值，从而破坏牙齿的硬组织[37，38］．SMR-3B可能增加变形链球菌通过抑制唾液中的生长答:actinomycetemcomitans以及相关的龋齿风险。黏蛋白是维持口腔健康的先天免疫的主要组成部分，并作为抵御微生物和其他不利因素的屏障[39］．粘蛋白-7与唾液蛋白如富含脯氨酸的蛋白、stathrin结合运输到口腔，以避免蛋白质水解，并以化合物的形式提高抗菌蛋白的利用率。它还可以与位于细菌表面的蛋白质特异性结合，或直接诱导口腔内的聚集，以去除致龋微生物[40］．罗等人[41]调查了30个龋齿易感和无龋齿个体，收集了5分钟和2小时的珐琅获得的生物膜用于蛋白质组学分析。结果表明，黏蛋白-7在龋病组表达上调，但不受获得性生物膜形成时间的影响。一项对龋齿和无龋齿成年人唾液蛋白的横断面研究发现，龋齿的发生与黏液蛋白-7水平的下降有关。黏液素-7在2.5 ng/ml浓度下能较好地区分带龋和无龋状态，灵敏度和特异性均为100% [42］．唾液黏液蛋白浓度的变化主要发生在乳牙萌出之前[43]，说明当口腔在乳牙列期处于健康稳定状态时，其浓度不会发生显著波动。由于粘蛋白通过直接与微生物结合来预防龋齿的发生，唾液中的粘蛋白-7可能会影响口腔微生物定殖的类型;因此，它也能够侧面反映口腔微生物的变化。然而，之前的一项研究[44的研究表明，学龄前儿童唾液中黏液素-7的浓度在各种龋齿风险中没有太大差异。从我们的研究结果来看，这两种蛋白(SMR-3B和mucin-7)在不同组间的横断面比较中没有显著差异，它们只在个体龋病状态动态变化时发生。这些结果或许可以部分解释以往研究之间的矛盾。

目前，质谱技术的发展使同时测定蛋白质表达水平成为可能。然而，高维的结果使得样本难以可视化。主成分分析的出现通过降维简化了数据;因此，评估样本之间的异同更加直观[45］．建立了基于两种多肽的主成分分析模型。结果显示，在基线时，组间无明显的分离趋势，但有龋齿经历组和无龋齿经历组在3个月后呈分散趋势，且随时间推移逐渐显著。决策树模型也得出了类似的结论。两种不同的多肽米/z分别为1045.9和2517.6，可以更好地区分龋病高危个体，哪些人更容易发生龋病或治疗后复发。灵敏度达84.6%，具有一定的应用价值。这两种差异表达的多肽及其蛋白来源(SMR-3B和粘蛋白-7)在监测儿童高龋风险的动态变化方面具有巨大潜力。

在未来对这些发现进行外推之前，应考虑到本研究的某些局限性。首先，样本量略有限制。对于幼儿园儿童的参与者，由于在随访期间与家人搬回家、转学或毕业的原因，导致6个月随访时样本量减少，导致三组参与者数量不严格平衡。在这种情况下，一些参与者可能没有所有三个时间点的样本，这无疑会对结果产生一定的影响，虽然参与者在每组的年龄和性别配对，没有统计学上的显著差异，旨在减少不同组之间的不平衡样本量的影响。其次，据报道MALDI-TOF MS技术在检测低丰度多肽时存在困难[46]，但在本研究中用于肽谱的初步筛选仍然是一个合适的选择。此外，在本研究中没有精确测量蛋白质浓度，尽管之前的一些研究提出了使用相同收集方法使用等体积唾液的可行性，使用MALDI TOF MS比较不同样本之间的肽谱[31，47，48］．如果在后续的分析中进行更精确的量化、标准化和规范化程序，如果在研究的构思和设计阶段考虑到整体的蛋白质浓度，那么肯定会更好，而随着技术的发展，肽的检测和鉴定肯定会更加深入和准确。同时，蛋白质的验证程序(如Western blotting和ELISA)在未来的研究中对这些候选唾液生物标志物的验证肯定是有价值的。第三，所有参与本研究的参与者都来自同一所幼儿园，因此，该年龄组儿童的所有特征可能都不具有代表性。由于他们生活在相同的环境中，食用相同的饮食，并在相同的口腔卫生指导下，一些其他混杂因素的影响显著降低，考虑到相对较低的干扰水平，这当然是有利的。在今后的研究中，扩大样本量、延长随访期和采用不断发展的技术将有助于验证目前的研究结果和在这一领域进行更深入的调查。

综上所述，本研究采用纵向定期随访设计结合质谱技术筛选儿童唾液中的两种特异性蛋白，即SMR-3B和mucin-7，这两种蛋白有可能作为动态监测儿童龋病高危状态变化的候选生物标志物。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

MALDI-TOF女士:

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

LC-ESI-MS /女士:

液相色谱-电喷雾电离-串联质谱

SMR-3B:

上颌腺雄激素调节蛋白3B

PKUSSIRB:

北京大学口腔医学院(医院)机构审查委员会

SPSS:

统计产品和服务解决方案

我们衷心感谢参与者对本次研究的贡献。

国家自然科学基金项目(批准号:81801037)、北京大学口腔医学院暨口腔医院研究基金项目(批准号:PKUSS20170105)、北京大学口腔医学院暨口腔医院临床新技术与新疗法项目(批准号:PKUSSNCT-21B15)、中华人民共和国科技部项目(批准号:2018FY101005)资助。这些资助者在研究的设计、收集、分析和解释数据以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。

从属关系

1. 北京大学口腔医学院预防牙科，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床研究中心，口腔数字化与材料技术国家工程实验室，北京100081

   周新竹，李浩哲，朱策，袁超，孙翔宇，郑树国

2. 上海交通大学牙科学院，上海第九人民医院，上海，200011

   Ce朱

3. 北京市朝阳区亚运村第二幼儿园，北京，100101

   春花孟&冯树兰

贡献

XZZ和XYS负责研究设计、研究绩效、数据分析和稿件起草。HZL, CZ和CY进行了研究程序和数据分析。CHM和SLF参与了研究并对手稿提出了建议。SGZ初始化了研究设计、数据分析并对手稿进行了严格的修改。

相应的作者

对应到象屿的太阳或Shuguo郑．

伦理批准和同意参与

在本研究中，所有程序均按照《赫尔辛基宣言》进行，方案和其他相关材料由北京大学口腔医学院机构审查委员会(批准号:PKUSSIRB-201735057)批准。所有参与者的父母在研究开始前都签署了书面知情同意书。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献放弃书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限