摘要
背景
口腔是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2 (SARS-CoV-2)的主要入口。血管紧张素转换酶2 (ACE-2)、神经蛋白酶1 (NRP-1)和跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)是新冠病毒进入宿主细胞的必要条件。ACE-2和NRP-1受体以及TMPRSS2都在口腔中被发现。然而，关于根尖周病变及其代谢产物对这些关键基因表达的影响的知识有限。本研究旨在测量根尖周病变及其独特的脂肪酸(FAs)代谢物对上述基因表达的影响，以及白细胞介素6 (IL-6)基因的表达，从而估计SARS-CoV-2感染负荷。
方法
与健康口腔相比，在根尖周病变中检测ACE-2、NRP-1、TMPRSS2和IL-6的基因表达。由于FAs是受体合成和病毒复制所必需的脂质合成的重要免疫调节剂，因此使用气相色谱-质谱(GC-MS)在口腔病变和健康牙髓组织中测定了FAs的比较谱。在已知表达ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因的哺乳动物细胞上测试了主要识别的和独特的FAs的影响。
结果
基因表达分析显示，与口腔病变相比，健康临床样本中ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因表达显著上调，而IL-6基因表达则相反。饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸分别是主要的共享脂肪酸和独特脂肪酸。主要共享的FAs包括棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸，在健康口腔中比例最高，而独特的FAs包括尖周脓肿中的17-十八烷基酸，石油酸和l根尖周肉芽肿中可见-乳酸，根性囊肿中可见1-壬烯。计算预测表明，鉴定的FAs与ACE-2、TMPRSS2和S蛋白的结合亲和力不显著。此外，fa处理的哺乳动物细胞显示ACE-2, NRP-1和TMPRSS2基因显著过表达l-乳酸和油酸导致NRP-1基因下调，而17-十八烯酸对NRP-1基因下调影响不明显。
结论
总的来说，与伴有根尖周病变的口腔相比，健康的口腔更容易受到病毒感染。FAs在病毒感染中起重要作用，其平衡影响病毒载量。将平衡转向更高水平的棕榈酸、硬脂酸和1-壬烯导致上述基因的显著上调，从而导致更高的病毒载量。另一方面，炎症与SARS-CoV-2受体的表达呈反向相关。因此，一种能够降低棕榈酸、硬脂酸和1-壬烯水平，同时保持免疫调节作用的口腔制剂可作为未来对抗病毒感染的保护策略。
背景
由严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)疫情是一个全球性威胁[1］．口腔被认为是病毒的重要入口[2］．由于COVID-19停留的时间似乎更长，口腔健康和SARS-CoV-2感染之间的关系可以提供重要信息，帮助制定与这种传染性疾病相关的管理决策。另一方面，口腔根尖周病变等口腔病理状况引起的SARS-CoV-2感染并发症尚未见报道。通过口腔的病毒感染负荷受细胞膜结合受体和宿主蛋白酶的表达控制。研究强调血管紧张素转换酶2 (ACE-2)在口腔粘膜、舌[3.，4]、口腔、牙龈组织[4]，除正常及发炎的牙髓外[5］．此外，多项研究证实了神经蛋白酶-1 (NRP-1)作为SARS-CoV-2感染受体的作用[6，7，8］．NRP-1受体定位于正常舌的外基底上上皮层[9]在伤口愈合、血管生成、骨骼形成、牙齿形成等过程中起着不可或缺的作用[10，11，12，13]，以及牙髓干细胞的成牙细胞分化[14］．人宿主蛋白酶，特别是跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)酶对于激活人气道上皮细胞中的SARS-CoV-2 S蛋白至关重要[15］．TMPRSS2在口腔分层鳞状上皮、唾液和舌组织中高度表达[16］．
人体的代谢物，特别是FAs在病毒感染中也起着重要作用[17，18］．人体内存在的一些代谢物对病毒感染发挥保护作用，包括SARS-CoV-2 [19]，而另一些则使病情恶化[20.］．病理状态下的代谢物与健康状态下的代谢物不同。这些代谢物可以形成影响病毒感染的微环境。在本研究中，研究了与FAs微环境相关的ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因在根尖周病变与健康牙髓组织中的表达。然后评估上述基因表达和FAs微环境对口腔内SARS-CoV-2感染负荷的影响。
方法
细胞培养和代谢物
人胚胎肾(HEK293)细胞购自(ATCC®CRL1573™，美国)，并在Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12 (DMEM/F-12) (Sigma- d8437，德国)中培养，补充FBS (Sigma，德国)和青霉素-链霉素(Sigma，德国)。以HEK293细胞为模型细胞，该细胞正常表达ACE-2和NRP-1受体以及TMPRSS2酶，与SARS-CoV-2感染的高共病性有关。购买的代谢产物为棕榈酸(Sigma Aldrich，德国)、硬脂酸(Sigma Aldrich，德国)、油酸(Daejung，韩国)、17-十八烷基酸(Santa Cruz，美国)、1-壬烯(TCI，美国-日本)和l-乳酸(Sigma Aldrich，德国)。
样本的收集
本研究包括40个样本，男性28个，女性12个，年龄范围为15 - 60岁。选取10个根尖周脓肿、10个根尖前肉芽肿、10个根性囊肿和10个健康牙髓组织作为健康对照。对于所有根尖周病变，一般的纳入标准包括龋损、髓质坏死、根周透光性证据和骨丢失，以及根尖周脓肿病例的面部疼痛和肿胀[21］．排除标准包括全身性疾病、皮质类固醇治疗史、怀孕、放疗、牙齿活动能力和垂直牙齿骨折。采样过程如前所述[22，23］．使用11号无菌手术刀从根尖分离出根尖周围病变。手术拔除阻生智齿后收集健康牙髓组织样本，如前所述[24，25］．
收集的样本在10%中性缓冲福尔马林中固定至少24小时后，用标准的组织病理学程序进行确认，随后用石蜡包埋。采用传统苏木精染色和伊红染色对病变组织病理结构进行光学显微镜检查。根尖周肉芽肿和根性囊肿根据是否存在由上皮排列的透明腔来鉴别[26］．
口腔病变的脂肪酸谱分析
与健康对照组相比，口腔病变中的FA代谢物分析是根据先前描述的方法确定的[27，28］．简单地说，将冷冻的组织悬浮在甲醇:氯仿(1:1)中，然后在超声波器水浴中在室温下超声1小时。根据Soliman等人，2020年建立的协议，对过滤后的提取物进行衍生化和GC-MS分析[27］．代谢物提取物由N三甲基硅烷基)- - -N-三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(MSTFA + 1% TMS)， GC-MS分析使用QP2010气相色谱质谱计(GC-2010与QP-2010 Ultra相结合)，配备自动进样器(AOC-20i + s)，来自岛足(日本东京)，使用Rtx-5 ms色谱柱(30 m长× 0.25 mm内径× 0.25µm薄膜厚度:Restek, Bellefonte, PA)。FAs数据从NIST库识别的代谢物列表中提取。每种代谢物的平均%数量与每个样品的其他代谢物相关。各代谢物与健康对照的倍差显示。研究人员进行了全面的搜索，以确定FA与病毒感染，特别是与冠状病毒(包括COVID-19感染)相关的病毒感染(表2)1)．
FA蛋白结合亲和力的计算
所选FAs的三维结构以SDF文件的形式从PubChem数据库中下载，然后进行能量最小化，保存为PDBQT格式。蛋白质的三维晶体结构从蛋白质数据库(PDB)下载(http://www.rcsb.org)．制备蛋白质，加入氢，去除水、配体和杂离子。对接前用Chimera软件将蛋白质转换为大分子PDBQT格式。利用Pyrx Autodock结合引擎计算FAs与靶蛋白的结合亲和力。利用Autodock Vina作为对接引擎，将酸类代谢产物停靠在ace2 (PDB:1R4L)、TMPRSS2 (PDB: 2OQ5)和S蛋白(PDB: 6MOJ)的结合位点上。
用FAs处理哺乳动物细胞
HEK293细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12中培养，37℃，5% CO2．将FA代谢物溶解在DMSO中，制备1mg /ml的原液，然后用PBS稀释以获得所需浓度。用10 ng/ml和1000 ng/ml的棕榈酸、硬脂酸、油酸、17-十八烯酸、1-壬烯和l-乳酸培养48小时。然后收集细胞并保存在−20°C下进行下游实验。
实时定量PCR (qRT-PCR)
使用临床样本和处理过的HEK293细胞定量ACE-2、NRP-1 TMPRSS2和il -6转录本的基因表达。使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN，德国)从均质样品和处理过的细胞中分离rna，然后根据生产说明使用SuperScript™III第一链合成系统(ThermoFisher Scientific，美国)将rna逆转录为cDNA。引物序列列于表中2．如前所述，使用QuantStudio3进行RT-PCR建立和循环程序[54］．GAPDH被用作管家基因进行归一化，相对折叠变化用2^计算−(ΔΔCt)．
统计分析
收集的数据在Excel工作表中进行组织，并使用GraphPad(版本5.01)进行分析。采用单向或双向方差分析(ANOVA)分析提取的代谢物的数量和每个图所示的基因表达。计算代谢物的折叠变化，以比较病变与健康对照或组内代谢物的水平(面积%)。健康对照组中的油酸被表示为计算所有组中其他代谢物的近似折叠值的参考(表1)．
结果
健康口腔中ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因的表达高于根尖周损伤患者，IL-6基因的表达则相反
与健康对照组相比，为了估计口腔病变中的病毒感染负荷，分析了临床样本中ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因的表达。结果表明，与健康对照组相比，根尖周脓肿、根尖周肉芽肿和根性囊肿中ACE-2和NRP-1基因表达明显下调(P小于0.001)(图;1一个,B)．此外，TMPRSS2的表达也观察到了同样的模式(P小于0.05。1C).这些结果表明，与健康对照组相比，口腔病变中病毒感染所需的关键基因的表达显著降低。而IL-6基因表达明显上调(P小于0.01)在根尖周脓肿和肉芽肿中的作用，但在根性囊肿中的作用与健康对照组相比无显著性差异(图14)。1D)。
根尖周病变和健康对照的定量基因表达。鉴定的基因表达在组间表现为折叠变化。一个ACE2。BNRP-1。CTMPRSS2。Dil - 6的分泌。数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，采用Bonferroni多重比较检验计算统计学显著性，显著性水平用星号(*)表示P< 0.05;**P< 0.01: ***P< 0.001;＊＊＊＊P< 0.0001)。假定值< 0.05为显著。数据显示了10个样本基因表达的折叠变化
口腔病变的FAs明显低于健康对照组
脂肪酸是一种主要的代谢产物，可影响口腔的微环境，进而影响感染率[60，61］．FAs还在病毒复制所需的脂质合成中发挥重要作用[17，18］．因此，我们进行了口腔病变与健康口腔的FAs对比分析。将口腔病变中鉴定出的FAs的微环境与健康对照进行比较，然后与受体、TMPRSS2激活酶和IL-6免疫调节剂的表达相关，从而与口腔中SARS-CoV-2感染负荷相关。
定性和定量代谢组学分析表明，FAs在口腔健康对照组中比在根尖周口腔病变中高1)．棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸是健康对照组中比病变组中含量最多的饱和脂肪酸。文献检索显示，上述FAs在冠状病毒感染期间升高[29，35，36］．报告还表明棕榈酸和硬脂酸都有抗病毒活性[31］．油酸是一种单不饱和脂肪酸，据报道，在冠状病毒感染期间，油酸的含量也很高，而众所周知，油酸伴随有显著的抗病毒作用[31，49]和抗炎作用[50］．同样的,l-乳酸只存在于根尖周围肉芽肿中，在冠状病毒感染期间也有较高的含量[41]，并可发挥抗病毒作用[43]和抗炎作用[44，45］．
对接研究表明，所鉴定的FAs与靶蛋白结合的可能性较小
为了测试鉴定出的FAs在病毒感染中抑制关键蛋白的能力，将FAs与ACE-2、TMPRSS2和S蛋白进行分子对接。结果表明，与标准配体(包括依那普利、苯甲脒和卡莫司他)相比，鉴定出的FAs具有较低的结合亲和力3.)．
健康口腔FAs增强了ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因的表达
为了验证FAs在病毒感染负荷中的重要性，HEK293细胞作为内源性表达ACE-2、NRP-1和TMPRSS2的模型细胞，被选择病变与健康对照之间显著不同的FAs处理(表2)1)．使用了两种不同浓度的测试代谢物，代表病变和健康对照之间的差异。结果表明，随着棕榈酸浓度的增加，ACE-2转录本的基因表达量显著增加(P小于0.01)、硬脂酸(P小于0.001)，1-nonadecene (P小于0.001)(图;2A).其他脂肪酸代谢产物包括油酸、17-十八炔酸和l-乳酸对ACE-2表达无显著上调作用(图2)。2A)。此外，较高浓度的棕榈酸可上调NRP-1基因的表达(P小于0.05)和1-壬烯(P小于0.01)，且在较低的浓度l-乳酸(P小于0.05。2B).用硬脂酸、油酸和17-十八烯酸处理细胞时，NRP-1的表达不显著(图;2B). TMPRSS2基因表达也进行了检测，在较高浓度的所有FAs中，TMPRSS2基因表达均出现上调，尤其是在棕榈酸作用下(P小于0.05)、硬脂酸(P小于0.001)，1-壬烯(P小于0.001)，和l-乳酸(P小于0.05。2C).另一方面，与其他FAs相比，用高浓度油酸或17-十八烷基酸处理细胞时，ACE-2、NRP-1和TMPRSS2的表达受到不显著影响。这与表中报告的数据一致1．
处理后HEK293细胞的定量基因表达。用10 ng/ml和1000 ng/ml两种不同浓度的棕榈酸、硬脂酸、油酸、17-十八烯酸、1-壬烯和l-乳酸48小时。一个ACE2。BNRP-1。CTMPSS2。处理细胞的基因表达用相应的载体值归一化。数据采用双因素方差分析，Bonferroni多元比较检验计算统计学显著性，显著性水平用星号(*)表示P< 0.05;**P< 0.01;＊＊＊P< 0.001;＊＊＊＊P< 0.0001)。假定值< 0.05为显著。数据显示基因表达在3个重复中发生了倍增变化
总的来说，高浓度FAs特别是棕榈酸导致ACE-2、NRP-1和TMPRSS2基因表达显著上调，而硬脂酸则显著上调ACE-2和TMPRSS2基因表达。这表明健康口腔的病毒载量高于受损口腔(图2)。3.)．数据与表中所示一致1和无花果。1得了。此外，1-壬烯显著上调了ACE-2、NRP-1和TMPRSS2的基因表达，表明与其他根尖周病变相比，根性囊肿的病毒载量可能更高，但低于健康对照组。相反，由IL-6基因表达测定的炎症反应在根尖周脓肿和肉芽肿中高于根性囊肿和健康对照组(图2)。1D).另一方面，油酸和l-乳酸降低了NRP-1基因的表达。
对健康牙髓组织和根尖周病变中病毒感染负荷的总结估计。一个在健康的牙髓组织中，FAs(橙色所示)大量存在，这反过来又增加了宿主受体的表达(蓝色所示)，导致病毒感染负荷增加。B在根尖周病变中，低水平的FAs伴随着低水平的宿主受体表达，从而降低病毒感染负荷
讨论
SARS-CoV-2感染可因病理情况而复杂化，包括与病毒进入口腔有关的病理情况，如根尖周病变。口腔表达病毒进入和感染所需的关键蛋白受体如ACE-2和NRP-1和酶如TMPRSS2。因此，与健康口腔相比，研究了根尖周病变对病毒感染负荷的影响。我们的结果表明，与健康对照组相比，口腔病变中ACE-2、NRP-1和TMPRSS2的表达显著降低。为了探究其原因，与健康对照组相比，研究了口腔病变的FAs微环境，因为FAs在脂筏合成和受体表达中起着重要作用[18]，除了它们在病毒组装中的作用外[62和宿主免疫调节作用。结果表明，包括棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸在内的FAs在口腔健康对照组高于根尖周口腔病变组。此外，棕榈酸和硬脂酸处理的哺乳动物细胞表现出较高的ACE-2, NRP-1和TMPRSS2的表达，而油酸和l-乳酸降低NRP-1表达，对ACE-2表达影响不显著。这与以往报告的表中总结的其他冠状病毒数据一致1．另一方面，IL-6与SARS-CoV-2受体的表达呈反向相关(模型如图所示)。4)．这些数据估计，与根尖周损伤患者相比，健康患者的病毒感染载量更高。因此，在对COVID-19感染患者的健康牙齿进行牙科手术时，可能会对牙科卫生工作者产生不利的高交叉感染。研究结果可提出特别的预防措施及安全的环境，以防止疾病在与口腔有关的手术过程中传播，并纳入一般牙科指引[63，64］．
与健康口腔相比，SARS-CoV-2受体和IL-6表达对根尖周病变病毒感染负荷的反向相关影响模型
在我们的研究中，ACE-2和NRP-1在健康牙髓组织中的表达高于根尖周口腔病变，这与口腔癌(另一种口腔病理疾病)的结果不同。ACE-2 [65]及NRP-1 [9基因在口腔癌组织中的表达水平较高。与我们结果的差异可能归因于其他因素的变化，特别是炎症反应[66］．根据我们在图中的结果。1IL-6与受体表达呈反向相关，这与之前报道的ACE-2数据一致[67，68]及NRP-1 [69与炎症反应相关的表达。此外，油酸和l-乳酸是已知的免疫调节剂[70会降低受体的表达。与我们的结果相似，TMPRSS2基因在头颈部鳞状细胞癌口腔中的表达较低[71]，证实炎症反应等其他因素也可能参与其中。
在本研究中，通过评估正常和病理口腔中的FAs水平来预测SARS-CoV-2感染负荷。据报道，FAs代谢与COVID-19病例高度相关，这为其在增强或减少感染方面的作用提供了见解[72］．我们的研究结果表明，饱和FAs(如棕榈酸和硬脂酸)在健康牙髓组织中高度存在，并能够上调体内SARS-CoV-2受体的表达(图2)。1)和体外培养(图;2)．这些结果可能表明它们在病毒感染期间的作用，因为之前有报道称它们在冠状病毒感染期间含量很高[29］．已知这两种FAs都能增加鞘脂的合成和脂筏的形成，从而增加ACE-2受体的表达[18］．此外，两种FAs均具有较弱的抗病毒活性[31]和促炎作用[32，33，34］．
相比之下,l-乳酸是根尖周肉芽肿的唯一代谢物。哺乳动物细胞的处理l-乳酸对ACE-2的上调作用不明显(图;2A)基因表达但NRP-1显著下调(图;2B).与健康对照相比，SARS-CoV-2受体和IL-6在根尖周肉芽肿中的表达分别显著降低和升高(图。1)．这表明由于炎症导致受体表达下调，导致病毒在根尖周肉芽肿中的不利结合条件。在一致性,l-乳酸在冠状病毒感染期间呈高水平[41］．另一方面，l-乳酸具有抗病毒作用[43]和抗炎作用[44，45］．
不饱和脂肪酸的作用不同。在根尖周脓肿中报道的唯一单不饱和FA是17-十八炔酸。17-十八炔酸对冠状病毒感染的影响从未报道过。用17-十八炔酸处理的哺乳动物细胞对SARS-CoV-2受体的表达影响不明显。而在根尖周脓肿中，SARS-CoV-2受体明显低表达，IL-6表达较高。这些结果表明，根尖周脓肿暴露于较低的病毒感染负荷。另一方面，1-壬烯首次被鉴定为神经根囊肿中唯一的不饱和代谢物。虽然对于这种代谢物的生物活性存在一定的认识差距，但我们的研究显示SARS-CoV-2受体显著上调，这与体内研究不一致(图2)。1a - c)。在体外(代谢物处理的哺乳动物细胞)和体内(口腔病变)研究中，SARS-CoV-2受体表达的差异可能归因于炎症反应等其他因素的影响(图2)。1D).此外，石油酸等不饱和脂肪酸[52]、油酸[31，49]都具有抗病毒活性。
经计算，鉴定的FAs与SARS-CoV-2感染所需的关键蛋白质和酶的结合亲和力较低;因此，与亚油酸相比，还需要进行实验测试。亚油酸通过对S蛋白的构象改变被报道为一种很好的S蛋白阻滞剂[73]，尽管它显示出与本研究中鉴定的FAs相似的结合亲和力。
总之，与健康牙髓组织相比，包括根尖周脓肿、根尖周肉芽肿和根性囊肿在内的口腔病变的SARS-CoV-2感染所需的关键基因表达较低，预测病毒感染负荷较低。获得的结果还表明，饱和脂肪酸如棕榈酸和硬脂酸对上述基因的表达有优越的影响。口腔内FAs之间的平衡可能是病毒感染所需的蛋白质受体和酶的表达的不利因素。将平衡转向饱和FAs，如棕榈酸和硬脂酸，增加了病毒受体的表达，从而增加了健康牙髓组织的病毒载量。此外，免疫调节剂如油酸和l-乳酸可以降低SARS-CoV-2受体的表达，从而降低病毒载量。例如，可降低棕榈酸和硬脂酸水平并具有免疫调节作用的口腔制剂可用作预防病毒感染的制剂。
数据和材料的可用性
在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。
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确认
不适用。
资金
作者感谢Sandooq Al-Watan和沙迦大学(# 133006)对SS的慷慨支持，以及沙迦大学(CoV19-0308)对RH的慷慨支持。资助机构提供了研究所需的资金，但他们在设计研究、分析数据或撰写文章方面没有任何作用。
作者信息
从属关系
贡献
AM:获取数据，分析和解释数据，并起草文章。RH:数据的获取、分析和解释。电视:分析和解释数据。RH:数据解读、文章修改、资金获取。SS:研究的概念和设计，文章的起草和修改，以及资金的获取。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
相应的作者
道德声明
伦理批准并同意参与
所有根尖周脓肿、根尖周肉芽肿、根性囊肿和健康牙髓组织样本均来自沙迦大学牙科医学院口腔和颅面健康科学系。知情同意书来自于2019年2月17日在研究伦理委员会/沙迦大学注册的所有伦理批准患者，编号为REC-18-12-17-02-S。
发表同意书
不适用。
相互竞争的利益
作者宣称他们之间没有利益冲突。
额外的信息
出版商的注意
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权利和权限
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关于本文
引用本文
阿尔泰，上午，汉迪，R.，文卡塔查拉姆，T.。et al。SARS-CoV-2合并根尖周病变时口腔病毒载量的估算BMC口腔健康21日,567(2021)。https://doi.org/10.1186/s12903-021-01921-5
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- 口腔病变
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