纳豆激酶粗提物促进口腔黏膜炎愈合

背景

纳豆激酶(NK)由于其强大的纤溶活性，在预防和治疗心血管疾病方面是一个有前途的选择。在本研究中，我们研究了粗纳豆激酶提取物对醋酸诱导的小鼠口腔黏膜炎的愈合作用。

方法

枯草芽孢杆菌将培养基(BSCM)分离到上清液中，命名为纳豆激酶粗提物(NCE)，并命名为颗粒枯草芽孢杆菌质量(BSM)。应用50%冰醋酸建立小鼠口腔黏膜炎模型。根据治疗条件将小鼠分为BSCM组、NCE组、BSM组和PBS组。采用小鼠体重、口腔黏膜炎愈合评分和组织病理学检查评价治疗效果。

结果

BSCM、NCE和BSM的纤溶活性分别约为8069、10,800和80 U/ml。NCE组与PBS组治疗3天后小鼠体重增加有显著性差异(p< 0.05)。NCE组口腔黏膜炎评分显著高于其他各组(p< 0.05)。NCE组与其他组的组织病理学评分差异有统计学意义(p< 0.01)．

结论

NCE在减少疼痛和促进口腔黏膜炎愈合方面具有显著的潜力，且安全性较低。在本研究中，我们首先报道NCE来自于枯草芽孢杆菌能促进口腔黏膜炎的愈合，扩大了NK的应用范围。

口腔黏膜炎是上半身放疗或放化疗相关的不良反应之一[1，2］．在黏膜炎开始阶段，患者开始出现红斑，随后出现局部口腔黏膜脱屑[3.］．然后延长粘膜炎的进展，严重，粘膜的完整性被破坏，并且病变开始形成[4］．这些病变会引起轻微到严重的疼痛，通常会导致吞咽障碍，导致小鼠体重下降[5，6，7］．疼痛主要由炎症介质刺激，如前列腺素、5-羟色胺和炎症细胞分泌的缓激肽[8］．目前，常用联合治疗方法来控制疼痛，如用2%粘稠利多卡因溶液局部冲洗、漱口剂和其他全身镇痛药[9］．然而，大多数市面上出售的漱口水都含有酒精和其他成分，这会使患处敏感，让患者感到不适。因此，迫切需要开发温和的策略来促进口腔黏膜炎的愈合。

1987年，Sumi等人[10]首先命名了一种新型纤溶酶NK，这种酶在纳豆中发现，纳豆是日本传统饮食中一种典型而流行的发酵豆制品。NK是人体产生的最重要的胞外酶纳豆枯草芽孢杆菌［11］．体外和体内研究均证实NK具有强大的纤溶活性[12］．因此，NK现在被认为是一种有效，安全和经济酶，其溶栓药物研究中的核心关注[13，14，15，16］．此外，NK还被用于治疗阿尔茨海默病、玻璃体视网膜疾病和一些肿瘤[17，18］．临床试验还证明，增加NattOkinase的摄入量是有效预防和治疗高血压[19］．

最近的研究发现，NK通过抑制lps诱导的TLR4和NOX2的激活发挥其抗炎作用，可能有助于患者缓解疼痛[20.］．根据我们之前的研究，NK可以提高细胞干细胞性，诱导上皮细胞再生和血管生成，从而促进伤口愈合[21］．提示NK对口腔黏膜炎的愈合有一定的作用。

在这项研究中，我们旨在探讨小鼠体重，炎症和上皮再生进展的变化，以确定NCE在口腔粘膜炎治疗中的作用。

伦理批准

本研究中所进行的所有操作均符合相关指南和规定。动物实验经江苏大学医学伦理委员会和实验动物伦理委员会审查批准(IRB协议号:2012258)。此外，作者还遵循了《动物研究:体内实验报告指南》(the Animal Research: Reporting in vivo Experiments guidelines, ARRIVE)的所有指南。

中等文化条件

纳豆激酶的生产主要涉及菌种活化和发酵两个步骤。首先,纳豆枯草芽孢杆菌接种于种子培养基(2%氯化钠、1%蛋白胨、0.5%酵母膏和100 mL去离子水)。将种子培养物(0.5%，v/v)接种到37℃恒温培养24 h的发酵培养基中进行NK生产。发酵培养基由5%红豆粉、2%葡萄糖、1%氯化钠、0.1%磷酸氢二钾、0.1%磷酸氢二钾、0.01%氯化钙和0.05%硫酸镁。发酵培养基装在一个锥形烧瓶中，在37℃、225 rpm的摇床中培养72小时。

孤立的指标

从发酵培养基或BSCM中提取NCE。将BSCM以12,000×g离心8分钟，将液体上清液命名为NCE，并将颗粒重新悬浮在PBS中并命名为BSM。

琼脂糖纤维蛋白板的制备

用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定NCE及其他组分的纤溶活性。简单地说，用纤维蛋白原和琼脂糖溶液制成纤维蛋白平板。以尿激酶为标准。样品被投到平板上的孔里。37℃孵育18 h。最后，根据标准曲线测定纤维蛋白溶解活性。

小鼠口腔黏膜炎模型及治疗

成年雄性ICR小鼠(8周龄;体重25±2 g)，购自江苏大学(中国镇江)动物中心，单独放置于塑料笼中，在25±2℃、相对湿度60%条件下，光照-暗循环12小时。将直径2毫米的滤纸在50%醋酸中浸泡，置于麻醉小鼠下切牙唇穹窿区60秒形成病变[22，23］．这些老鼠被分成四组，每组5只。对照组采用PBS处理，其余各组分别采用BSCM、NCE和BSM处理。在治疗后3、6和10天，我们拍摄口腔黏膜炎病变。三位校正和盲法观察者通过特定的评估标准来评估口腔黏膜炎的愈合情况，并计算观察者之间的差异。(0:模型初始病变，红色、灰色假膜;1:病变破坏，假膜未漂白，明显渗出，发红;2:病灶会聚，轻度发红，渗出少;3:病变明显变小，稍渗出，稍发红;4:病变完全愈合)。 Finally, the mice were sacrificed and the lesion tissue were resected for further analysis.

小鼠体重测定

我们在治疗后每天记录小鼠的重量。相对权重= [（dn−d0/d0]（d0是老鼠的原始重量，dn为n天后记录的小鼠体重)。

组织病理学检查

病变组织用4%多聚甲醛(pH 7.4)固定，逐渐脱水，石蜡包埋。用切片机(Leica, RM2145, Germany)获得4微米厚的切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色以评估炎症反应和组织学变化。图像是用显微镜(Zeiss, Axio Scope A1，德国)拍摄的。三位校正和盲法观察者参与评估组织病理学图像，并计算观察者间的变异性。对H&E染色的病变进行分析并按以下评价标准评分(0:血管扩张、白细胞浸润、口腔上皮破坏;0.5:血管收缩，白细胞下降，口腔上皮破坏;1:血管收缩，白细胞下降，口腔上皮破坏及少量淋巴细胞;1.5:血管明显破坏，未见白细胞，口腔上皮破坏，淋巴细胞大量;2:血管正常，白细胞未见，淋巴细胞少数;2.5:血管正常，未见白细胞，未见愈合的口腔上皮和淋巴细胞)。

统计分析

数据显示为平均值±SD。使用学生的T测试（两组）或使用Prism 5.0软件（GraphPad，San Diego，CA）进行单向分析或单向分析差异（ANOVA;多组）的单向分析。P值<0.05被认为是显着的。

纤溶活性检测

不同组分的纤溶活性枯草芽孢杆菌培养基用琼脂糖纤维蛋白板检测。结果显示，NCE的纤溶活性约为8069 U/ml, BSCM的纤溶活性约为10,800 U/ml, BSM的纤溶活性仅为80 U/ml(图3)。1）。

NCE可增加口腔黏膜炎小鼠的相对重量

建立小鼠口腔黏膜炎模型，以给药后小鼠的相对体重评价口腔黏膜炎愈合程度。如图所示。2， NCE组与PBS组治疗3天后小鼠体重增加有显著性差异(p< 0.05)其余各组小鼠体重至治疗后第5天均无增加。

NCE加速口腔黏膜炎的愈合

一般的图片表明，NCE组中的口腔粘膜炎面积减少，渗出物在治疗后第3天的其他三组的渗出物小于其他三组。令人惊讶的是，NCE组的口腔粘膜病变与治疗后第6天的其他三组相比愈合。PBS未促进口服粘液炎愈合（图。3.a).口腔黏膜炎评分分析如图所示。3.b, NCE组评分显著高于PBS组(p< 0.05)。口腔黏膜炎评分比较见表1．

NCE可促进口腔黏膜炎的黏膜上皮再生

H&E染色结果显示，乙酸处理后72 h各组上皮细胞均被破坏，并伴有严重的炎症细胞浸润。治疗3 d后，NCE组病灶变小，炎症细胞浸润减少。治疗后第6天，NCE组上皮细胞完全恢复，无炎症细胞浸润，其余3组上皮细胞未修复，仍有炎症细胞浸润(图1)。4a).如图所示。4B，NCE组和PBS组之间的组织病理学分数差异有统计学意义（p< 0.01)．

在这里，我们证实了NCE在口腔黏膜炎愈合中的作用。我们发现在小鼠口腔黏膜炎模型中NCE与体重变化、炎症控制和上皮再生密切相关。

口腔黏膜炎的临床特征为弥漫性粘膜红斑和溃疡，并伴有口喉疼痛[24，妨碍进食和吞咽[25］．特别是，吃冷、热、酸和刺激性食物往往会引起剧烈疼痛，严重影响生活质量[26］．许多治疗口腔黏膜炎的干预措施已被开发出来，如口服硫酸锌、洗必泰、蜂蜜和激光治疗[27，28，29］．然而，这些干预会给患者带来额外的痛苦。在本研究中，我们发现nce处理组小鼠体重在4^th行政后一天与其他群体相比，这表明NCE可能缓解口腔粘膜炎引起的疼痛，并增加与进食和饮用相关的小鼠体重。

既往研究证实，过多的炎症细胞和因子参与口腔黏膜炎的形成，刺激感觉神经末梢[30.］．抗炎剂被认为是控制口腔粘膜炎症的症状的一线试剂。在我们的研究中，根据组织学发现，NCE组在第6天具有比其他组更好的上皮愈合和中度慢性炎症，表明NCE可以减少过度炎症反应并对口腔粘膜炎症进行治疗作用。

加速愈合过程，减少疼痛和复发的机会是目前治疗的主要目的[31］．几种天然化合物可以作为膳食补充剂来治疗皮肤和口腔黏膜炎，我们的研究扩展了这个列表[32］．作为一种食物，NK已被广泛证明是安全的，并且毒理学评估还表明NK的口服消耗低毒理学关注[16］．

口腔粘膜愈合是一种多因素过程，涉及炎症，细胞增殖，迁移和结缔组织改造[6］．虽然我们已经证明NCE治疗口腔黏膜炎是有效的，但其具体的分子机制尚不清楚，值得进一步研究。

NCE在减少疼痛和促进口腔黏膜炎愈合方面具有显著的潜力，且安全性较低。在本研究中，我们首先报道NCE来自于枯草芽孢杆菌能促进口腔黏膜炎的愈合，是一种有效的替代传统治疗方法。

各种原始数据和方法用于支持本研究的发现，可从通信作者的要求。

BSCM:

枯草芽孢杆菌文化传媒

BSM:

枯草芽孢杆菌质量

):

苏木精和伊红

NCE：

粗提物纳豆激酶

NK:

nattokinase.

PBS:

磷酸缓冲盐

不适用。

本研究由国家自然科学基金项目(no . 81772694, no . 81372718)资助。

从属关系

1. 江苏大学医学院细胞生物学教研室，镇江市学府路301号，212003

   张俊瑶，唐煜，袁涛，杨梦婷，方文静，李莉，费飞，龚爱华

贡献

JZ和AG构建了这个想法和设计了这项研究。JZ和YT写了主要的稿件文本。Ty准备的图。1和2和我准备的无花果。3.和4．所有作者都参与了实验和数据收集。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到艾华龚．

伦理批准和同意参与

本研究中所进行的所有操作均符合相关指南和规定。动物实验经江苏大学医学伦理委员会和实验动物伦理委员会审查批准(IRB协议号:2012258)。此外，作者还遵循了《动物研究:体内实验报告指南》(the Animal Research: Reporting in vivo Experiments guidelines, ARRIVE)的所有指南。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争利益。

出版商的注意

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