根尖周肉芽肿中MMP的基线表达及其与根管治疗后根尖周伤口愈合的关系

背景

基质金属蛋白酶(MMPs)催化细胞外基质组分的降解，在包括伤口愈合在内的许多生理过程中起着重要作用。在目前的研究中，我们检查了基线MMPs 1、2、7和9的表达与根管治疗后根尖周伤口愈合的相关性。

方法

本研究纳入27例年龄在15 - 57岁之间的前牙慢性根尖周炎或慢性根尖脓肿患者，他们曾尝试或失败过根管治疗。在外科根管治疗期间，从根尖周病变样本中收集组织，用于大体组织病理学分析以及MMPs 1、2、7和9的mRNA表达分析。患者在6个月后被召回进行随访，以评估临床和影像学的愈合状态，愈合与基线MMP表达相关。

结果

在27例患者中，15例患者在6个月结束时观察到愈合，21例患者在12个月后观察到愈合。6例患者在12个月后仍未愈合。基线mmp1、2、7和9表达水平与愈合状态的分析显示，与愈合组相比，未愈合组MMP2和MMP9的平均相对表达量显著增加。

结论

MMP2和MMP9的过表达可能被认为是根管治疗后根尖周伤口愈合的潜在预后生物标志物。然而，需要进一步的研究来确定其与根尖周伤口愈合的确切关系。

根尖周病变的特征是颌骨根周组织的炎性骨溶解病变，具有根管起源。根尖周肉芽肿(PG)是最常见的根尖周病变类型，是受感染根管持续抗原刺激的结果[1］．放射学上，这些病变表现为围绕坏死牙尖的单眼透光。组织学上，根尖周肉芽肿由肉芽组织组成，混合有浆细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和少量中性粒细胞的炎症浸润;新生血管及神经纤维[2］．当坏死性牙髓的细菌毒素通过根尖孔到达根尖周组织时，会引起局部炎症反应的级联反应。因此，一些促炎细胞因子、趋化因子、免疫调节介质和神经肽被释放到根尖周组织环境中，导致细胞外基质(ECM)降解和根尖周骨破坏[3.］．

根尖周肉芽肿主要采用传统的根管治疗。但常规根管治疗后根尖周病变愈合失败或无法通过非手术方式进行适当治疗时，应选择手术治疗。现在临床证明，即使按照相同的治疗方案进行治疗，患者对根尖周伤口愈合的反应也可能不同。有人认为个体基因型可能是造成伤口愈合差异的原因[3.］．此外，病变环境中某些标记物的表达改变也与愈合结果有关[3.］．

伤口愈合是由炎症、肉芽组织形成、血管生成和组织重塑等一系列事件所表征的。这些过程发生在所有组织中，与损伤类型无关[4］．一些研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)参与了根尖周区骨基质和ECM组分的分解代谢翻转。MMPs是一组锌和钙依赖的内源性膜结合酶，介导ECM和骨基质的降解和重塑[5］．这些酶由各种细胞产生，包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、炎症细胞和成胶细胞样细胞。迄今为止，已知超过25种基质蛋白在组织形态发生、修复、重塑和伤口愈合等生理过程中起着重要作用。然而，许多研究表明基质金属蛋白酶在根尖周炎期间的双重作用，在根尖周炎中，先天和适应性免疫反应被激活，以对抗来自失活牙齿的入侵病原体及其副产物[6，7］．例如，Belmar等人．［8]发现根尖周感染患者的龈沟液中MMP-2和MMP-9浓度增加，而Ahmed等人．［9]报道了MMP-9在根尖周肉芽肿中的高表达，提示其在这些病变的进展中起积极作用。此外，Hadziabic等人．［10]发现与囊肿相比，根尖周肉芽肿中MMP-1和MMP-2水平升高，但无统计学意义。虽然许多研究得出结论，MMPs水平升高会导致伤口慢性不愈合[9，11，12］．

然而，阐明基线基因表达在根管治疗后根尖周伤口愈合中的作用的前瞻性临床研究很少有文献记载。本研究假设在根尖肉芽肿中基线MMPs 1、2、7、9的表达与根管治疗后根尖周创面愈合存在相关性。一项前瞻性的纵向临床研究评估了MMP的基线表达，及其与根尖切除术后临床和放射学上的根尖周伤口愈合的相关性，可以强调基线MMP表达作为根尖周伤口愈合的潜在预后生物标志物，并可能有助于提供以患者为中心的治疗方式，作为根管治疗的辅助手术。

病人的选择

研究参与者于2017年11月至2019年10月期间从陶氏健康科学大学手术牙科系招募。该研究方案由陶氏健康科学大学机构审查委员会批准(编号:IRB-862/DUHS/Approval/2017/50)。在开始治疗前，所有患者均获得知情同意。

年龄在15岁至57岁之间，前牙有慢性根尖牙周炎或慢性根尖脓肿，曾尝试过或失败过根管治疗，影像学表现为根尖周围放射透光(大于4mm)，硬膜层、牙周韧带间隙缺失，单根牙在根根关闭前曾遭受创伤，出现持续性根尖周病变。最初共有52例符合研究纳入标准的患者被纳入研究。这些患者在常规重根管治疗后随访长达6个月，并评估愈合情况。最终，在52个样本中，由于各种原因，如愈合证据(体征和症状消失)不符合纳入标准，根尖周组织不足以提取核酸，组织质量受损等，仅选择了27个参与者的样本进行遗传分析。这种方法和样本量也在其他研究中得到了应用[13，14，15］．有任何无法控制的全身性疾病或ASA III级、多根牙、单根牙根尖周病变小于4mm、已有牙周病等疾病的患者、孕妇或哺乳期妇女、常规重根管治疗后观察到愈合的患者均排除在本研究之外。

治疗方案和组织提取

术前用圆锥指示器和参考标记物拍摄根尖周x线片，放置在传感器上。常规重根管治疗，3 ~ 6个月后复查根尖周愈合情况，未见根尖周愈合的患者行根尖周手术。局部麻醉1:8万利多卡因加肾上腺素，抬高全层黏液骨膜瓣。在确定根尖周病变部位后，用慢速手机用小圆针2 (Mani，日本)去除皮质骨，形成一个窗口。根尖周病变用刮匙去除(Hilbro，日本)。在超声尖端的帮助下进行根尖切除术和逆行腔准备(Pro ultra, DENTSPLY Maillefer，瑞士)，逆行填充使用MTA (Pro-root MTA, DENTSPLY Tulsa Dental Specialties, USA)。然后重新定位皮瓣并用3/0丝线缝合(ETHICON, LLC)。

收集根尖周病变的组织，立即分成两个片段:一个片段转移到RNA缓冲液中，后填充1.5 mL消毒离心管，保存在−80°C，直到均质提取RNA，第二个片段用于组织病理学分析。

用于组织病理学分析的组织处理

从根尖切除后，粘附的病变组织立即保存在10%缓冲福尔马林中，直到组织病理学分析。然后将每个病变组织置于组织处理器(PT09, Lupetec, Sao Carlos, SP, Brazil)中，在那里用越来越浓的乙醇处理它们，然后用二甲苯进行处理，然后用石蜡包埋。然后将这些石蜡块切成5微米的切片进行组织病理学检查。在脱仿过程中，5 μ m切片用两组二甲苯处理，在降低浓度的乙醇中水化，用自来水和蒸馏水清洗，然后放入苏木精中3分钟。然后在自来水中洗涤15分钟，然后浸入70%乙醇中，然后在伊红中保存5分钟。最后，样品在无水乙醇中浸泡四次，二甲苯中浸泡三次，然后用Enthelan®(Merck, Darmstadt, Germany)用盖套安装。使用尼康Eclipse E200光学显微镜(尼康仪器公司，东京，日本)对苏木精-伊红染色玻片进行显微分析。本研究仅纳入根尖周肉芽肿的病变。根尖周肉芽肿被纤维结缔组织包围，可见巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨细胞、成纤维细胞和肥大细胞。

组织加工用于RNA提取和cDNA合成

按照制造商的说明，使用珠磨均质法从每个冷冻的根尖周围肉芽肿组织中纯化总RNA。组织在2 mL离心管中称量，离心管中已经含有0.4 g 0.5 mm玻璃微珠和1% β-巯基乙醇，含有500 μ L RLT Buffer (Qiagen, Hilden，德国)。然后在Omni公司的24号拆珠机(Omni International, Kennesaw, GA, USA)对管进行珠磨均质化处理。然后根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从匀浆中纯化总RNA。RNA浓度和纯度通过纳米滴和aliquote进行量化，保存在−80°C，直到进一步使用。

RNA使用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)进行逆转录。RNA模板(5µL)与1µL OligodT(0.5µg/µL)、1µL dNTPs 10µM和8µL Nuclease free water混合，在65°C的预热块上孵育5分钟。孵育结束时，反应混合物立即在冰上冷却5分钟，然后短暂旋转，使内容物降至管的底部。将该反应与含有4µL M-MLV RT 5 ×反应缓冲液和1µL M-MLV逆转录酶(10,000U)的反应混合物结合，使体积达到20µL。该反应混合物在Eppendorf (Hamburg, Germany)热循环器中，50°C孵卵30分钟，85°C孵卵5分钟，4°C孵卵。

金属蛋白酶基因定量聚合酶链反应

利用cDNA样本进行定量pcr (qPCR)检测MMP -1、-2、-7、-9基因的表达水平。β-肌动蛋白作为管家基因，并使用相应引物组对qPCR结果进行归一化。表中列出了用于测量MMP和β-肌动蛋白水平的引物列表1．

为了进行qPCR分析，使用以下配方制备了20uL的反应混合物:2uL cDNA, 0.6µL (10 pmol/µL)正向和反向引物，10uL Evergreen qPCR主混合物(ABM, Canada)。qPCR反应在CFX96™Real-Time PCR系统(BIO-RAD, USA)上进行，采用热循环方案:95°C下10 min, 95°C下15 s, 57°C下30 s，循环40次。只有四个总RNA浓度较低的样本被允许进行60次循环。在40/60循环结束时进行熔体曲线(55-95°C)分析，以验证PCR产物的身份。所有反应均重复进行。相对基因表达量计算公式如下:

其中A =持家基因的平均Ct, B =感兴趣基因(MMPs)的平均Ct。

在接下来的步骤中，我们应用方差分析和Tukey的多重比较检验来确定所有被测MMPs在治疗者和非治疗者中相对基因表达的显著性差异，其中p< 0.05为有统计学意义。

患者概况和临床特征

人口学资料显示，患者平均年龄为22.81±7.45岁。本研究共纳入男性患者20例，女性患者7例。27例患者中，5例为吸烟者。患者术前临床表现见表2．超过一半(55.55%)的患者主诉疼痛、肿胀和/或窦道。20例(74.07%)患者存在叩诊压痛。

研究中纳入的患者的x线片显示，所有患者在治疗前都存在根尖周放射通透性(图2)。1)．所有患者术前PAI评分均为4或5分。

在根尖周手术6个月和12个月后，患者被召回进行随访，以评估临床和影像学的愈合状态。治疗组包括在随访期结束时没有任何疼痛、肿胀、窦道和/或叩诊压痛的患者，而非治疗组包括出现上述任何体征和症状的患者。这些患者的临床随访结果汇总于表中3.．观察到，在27名患者中，11名患者被归为非治疗者，而在6个月结束时，16名患者被归为治疗者。在12个月结束时，只有6例患者被认为是非治愈者，其余患者临床治愈。

愈合和不愈合的特征也基于x线表现。采用根尖周指数(PAI)评价放射治疗效果。PAI得分1和2被认为是愈合，而PAI得分3到5被认为是未愈合。随访期后的x线检查结果汇总于表中4．6个月和12个月后，所有患者的根尖周照射度均未增加。27例患者中，15例(55.55%)患者在6个月后愈合，21例(77.77%)患者在12个月后愈合。12例患者(44.44%)在6个月结束时未愈合，只有6例患者(22.22)在12个月结束时未愈合。

组织病理学分析

根据Omoregie et al.和Neville et al.的诊断标准对根尖周围肉芽肿组织进行分析．［16，17］．愈合组组织病理学图像以根尖周肉芽肿为主，肉芽组织高度发达，血管突出，淋巴细胞、浆细胞、组织细胞等炎性细胞浸润明显(图2)。2a - c)。未愈合组的组织学切片也显示根尖周肉芽肿组织学，纤维结缔组织丰富，成纤维细胞数量明显，炎症细胞浸润少，血管较少(图2)。2D)。

愈合组与未愈合组MMP的基线表达分析

在本研究中，在基线时测定了MMP1、MMP2、MMP7和MMP9的相对基因表达。我们发现MMP2和MMP9的平均相对表达量在未愈合组显著增加(分别为94%和89%;p基线< 0.05)，而愈合组(90.59%和89%;无花果。3.)．此外，与愈合组相比，未愈合组基线时MMP7的平均相对表达量较低，但差异无统计学意义(图2)。3.)．

在接下来的步骤中，我们应用Pearson相关检验来确定愈合组与未愈合组中MMP基因相对表达的相关性5)．在愈合组中，MMP-1, MMP-2和MMP-9之间观察到中度正相关(p< 0.05;表格5)，而MMP-2和MMP-9之间则呈强正相关(p< 0.05;表格5)．有趣的是，MMP-7与MMP-2和MMP-9呈弱负相关(p< 0.05;表格5)．在未愈合组中，任何MMPs之间的相关性均无统计学意义(表2)5)．

本研究旨在评估MMPs的基线表达及其与根管治疗后根尖周伤口愈合的关系。本研究结果显示，愈合组与未愈合组中MMP2和MMP9的平均相对表达量存在统计学意义上的差异，因此，原假设(在根尖肉芽肿中基线MMPs 1、2、7、9表达量与根管治疗后根尖伤口愈合无相关性)被拒绝。

基质金属蛋白酶(MMP)是一个重要的蛋白水解酶家族，与炎症、组织重塑和伤口愈合有关[11］．在正常情况下，基质金属蛋白酶的表达水平较低，但在炎症和伤口愈合期间，基质金属蛋白酶的表达水平显著升高[11］．在本研究中，未愈合组MMP2和MMP9的平均相对表达量差异有统计学意义(分别为94%和89%;p基线< 0.05)，与愈合组(90.59%和89%)相比。目前的发现也得到了Faustino等人的支持。18]，他们报告在有症状的根尖周病变中MMP-2和MMP-9的表达显著升高，并提示它们在疾病的病因学和进展中起着至关重要的作用。他们进一步证明，与根尖周囊肿相比，这些酶在根尖周肉芽肿中表达更高。高滨等人最近的一项研究[19]得出结论，在根管病原体放线菌存在时，根尖周肉芽肿表现出MMP-2表达升高，OPG表达降低，RANKL:OPG比值增大。

在愈合组中，我们也发现MMP1和MMP2、MMP9的平均表达呈显著正相关，而MMP-7和MMP-2、MMP-9的平均表达呈弱负相关。许多研究者报道了根尖周炎患者中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-13、MMP-14、MMP-16、MMP-19和MMP-25表达的相关性[13，20.，21］．然而，据我们所知，没有一名研究人员报道了根管治疗后基质金属蛋白酶的基线表达与根尖周伤口愈合之间的相关性。多项研究支持基质金属蛋白酶在伤口愈合中的作用，其中MMP1、MMP2、MMP7和MMP9已被证明在慢性根尖脓肿中发挥重要作用[9，10，11］．目前的研究结果也得到了Dezerega等人的证实．［22和Martinho等人．［23]，他们报告了与健康组织相比，根尖周病变中MMP-2和MMP-9的过表达以及促氧化特征。与正常健康组织相比，MMP-9较高的mRNA表达水平可能是由于启动子区DNA的非甲基化。Carneiro等人．［24]也通过免疫组化染色和实时荧光定量PCR证实MMP-9、CD68 +和部分炎症细胞参与根尖周炎病变细胞外基质(ECM)的降解。此前，Shi等人．［25]通过伤口愈合实验，分析穿心莲内酯对结直肠癌的抑制作用，发现MMP-7表达下调，但MMP-2和MMP-9表达保持不变。相反，有研究表明，MMP-7水平的升高在肠上皮创面的闭合中起着重要作用，当MMP-7活性被阻断时，创面的闭合速度会延迟。他们还提出，对于正常的伤口闭合，MMP-7的边际增加是至关重要的;然而，其过表达可能会减缓肠上皮伤口的愈合[26］．在一项研究中，研究人员调查了血清MMP-2、MMP-3和MMP-7在创伤性战争伤口中的作用，并将其与正常和受损伤口愈合进行了比较。他们发现血清中MMP-7和MMP-2水平较高，MMP-3水平较低[27］．

本研究随访1年是根尖周愈合评估相当合理的时间;然而，Kruse等人[18]表明1年不足以进行成功的愈合评估。他们强调，不同的决定因素与手术牙髓治疗无关，可能会影响长期的结果。然而，Song等人。19]报道，在一项前瞻性研究中，随访6年和10年的结果没有差异，其中93.3%的显微手术治疗在5年后保持不变。根尖周肉芽肿根据早期研究和诊断标准可分为早期、中期和晚期三个阶段[16，17］．早期表现为肉芽组织，伴有大量中性粒细胞、明显的泡沫状巨噬细胞和血管，中期表现为肉芽组织高度发达，血管突出，淋巴细胞、浆细胞和组织细胞等炎性细胞浸润明显。晚期根尖周肉芽肿表现为纤维结缔组织，有大量成纤维细胞和炎症细胞浸润。有趣的是，未愈合组出现晚期根尖周围肉芽肿，愈合组出现早期和中期肉芽肿。令人惊讶的是，这种独特的根尖周伤口愈合与不同阶段的根尖周肉芽肿的相关性在研究文献中缺乏。

值得一提的是，使用MTA等具有良好密封性的逆行充填材料，维持了手术根管治疗的质量。28］．此外，为避免偏倚风险，仅由首席研究员进行根尖切除术，由两名盲眼牙髓医生进行x线解释。同时还计算了评估术后x线片的检查者间可靠性。本研究的发现必须考虑到一些局限性。首先，由于无法获得根管显微镜和显微外科器械，患者接受了常规的外科根管治疗。其次，这项研究只在单根牙齿上进行。同样不可避免的是，由于患者的可用性/同意，所以样本量较小，较大的样本量可能会有不同的结果，因此应谨慎解释结果。最后，仅检测基线MMP表达，而应考虑6个月和12个月时MMP表达。然而，出于道德原因，这一目标无法完成，而且缺乏患者的同意，因为在手术后几个月收集组织样本，特别是在治疗者身上，将是一个不必要的手术过程。尽管如此，这项研究强调了基线MMP表达和伤口愈合的重要性。 Further studies may suggest MMP as putative prognostic biomarkers for periapical wound healing or non-healing.

综上所述，MMP2和MMP9的过表达可能被认为是根管治疗后根尖周伤口愈合的潜在预后生物标志物。因此，有必要进一步研究其与根尖周伤口愈合的确切关系。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

作者还感谢沙特国王大学的科学研究院长通过科学研究副院长、工程师提供的支持。Abdullah Bugshan，牙科和口腔康复研究主席。

本研究由高等教育委员会资助。5217 /信德省NRPU /研发/ HEC / 2016。作者还感谢沙特国王大学的科学研究院长通过科学研究副院长、工程师提供的支持。Abdullah Bugshan，牙科和口腔康复研究主席。

作者指出

1. Muhammad Adeel Ahmed, Muhammad Faraz Anwar, Muhammad Nouman Mughal和Syed Hani Abidi对这项工作做出了同样的贡献

从属关系

1. 巴基斯坦卡拉奇陶氏健康科学大学牙科手术系和生物医学研究所

   穆罕默德·阿迪尔·艾哈迈德

2. 沙特阿拉伯阿尔阿萨费萨尔国王大学牙科学院牙髓修复系

   穆罕默德·阿迪尔·艾哈迈德

3. 阿加汗大学生物和生物医学科学系，巴基斯坦卡拉奇

   Muhammad Faraz Anwar, Khalid Ahmed, Fizza Nazim, Nouman Mughal和Syed Hani Abidi

4. 巴利亚大学医学和牙科学院生物化学系，巴基斯坦卡拉奇

   穆罕默德·法拉兹·安瓦尔

5. 巴基斯坦卡拉奇陶氏健康科学大学伊什拉特-伊巴德·汗口腔健康科学研究所牙科手术部

   Marziya阿夫塔

6. 巴基斯坦卡拉奇市陶氏健康科学大学伊什拉特-伊巴德·汗口腔健康科学研究所病理科

   Muhammad Furqan Bari

7. 萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹亲王大学牙科学院保守牙科科学系，沙特阿拉伯哈尔吉

   穆罕默德·穆斯塔法

8. 义肢牙科科学系，工程师Abdullah Bugshan，牙科和口腔康复研究主席，沙特阿拉伯利雅得，沙特国王大学牙科学院

   法希姆Vohra

9. 修复牙科科学系，工程师Abdullah Bugshan，牙科和口腔康复研究主席，沙特阿拉伯利雅得，沙特国王大学牙科学院

   阿里Alrahlah

10. 阿加汗大学外科，卡拉奇，巴基斯坦

    Nouman莫卧儿王朝

贡献

样本收集，方法论，数据分析，撰写初稿:MAA, MFA, KA, MA, FN, MFB, MM, FV, AA。构思、监督、审核初稿和定稿:NM、SHA。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Nouman莫卧儿王朝或赛义德·哈尼·阿比迪．

伦理批准并同意参与

该研究方案由陶氏健康科学大学机构审查委员会批准(编号:IRB-862/DUHS/Approval/2017/50)。在开始治疗前，所有患者均获得知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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