不同直径或锥度根管内光子引发光声流的抑菌效果

背景

近年来，微创牙髓学的概念被提出，可以描述为通过保留更多的牙组织，造成最小的损伤来预防或治疗疾病。在根管预备过程中，建议使用锥度较小的器械，以保存更多的牙齿组织，提高患牙的保存率。光子诱导光声流(PIPS)是一种新型的激光激活灌溉技术，目前广泛应用于根管治疗。本文的目的是评价含NaOCl的PIPS对不同宽度或锥度根管的杀菌效果。

方法

本研究共纳入23颗上颌第一磨牙，均有3个独立根管。近端颊根管(MB)、下颚根管(DB)和腭根管(P)均按10/ #大小制备。02 # 25 /。02和#25/。分别06。在菌悬液中培养4周后，用常规针灌(CNI) (n = 10)或PIPS (n = 10)激活的2% NaOCl冲洗标本。3个标本未处理(对照组)。灌洗前后，用腺苷5’-三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒评估细菌的存在，用共聚焦激光扫描显微镜和扫描电子显微镜评估生物膜。

结果

在用PIPS灌溉制备的样品中，ATP降低了98%以上。当根管锥度为0.02时，在所有区域，25号根管的死菌比例均高于10号根管(P< 0．05) PIPS组。当根管宽度为#25时，0.02锥度组根尖区死菌率高于0.06锥度组(P< 0．05)，但冠状区及中部区除外(P> 0．05）.PIPS灌溉导致更大比例的死亡细菌和减少ATP大小#10/。2根管比CNI的根管尺寸#25/。06三个区域的根管(P< 0．05）.

结论

将宽度从#10增加到#25可以提高根管中pip的杀菌效果。在25号尺寸下，根管的锥度从0.02增加到0.06并不影响PIPS的杀菌效果。与CNI相比，PIPS在锥形和根管宽度较小的标本中导致更多的死菌。PIPS可用于清洁冠状区涂抹层，打开牙本质小管。

临床意义:与CNI相比，PIPS激活冲洗液可显著减少细菌，使牙根管的锥度和宽度变小，有利于防止牙齿组织的过度损失，保持牙齿结构的完整性。

在根管治疗中，完全清除软组织、感染碎片和微生物仍然是一个挑战[1]。由于根管复杂的解剖结构，在根管预备过程中，根管的一部分仍未被触及。这可能继续存在于根管系统，导致治疗后的牙髓疾病[2]。化学机械预备是根管治疗成功的关键步骤。机械制剂和冲洗液在进行清创术和清除根管系统中的重要和坏死组织、碎片和微生物方面起着关键作用[3.]。研究表明，较大的根管预备宽度和锥度可以提高根管灌溉的效果;然而，通过扩大沟渠来优化灌溉的机械效果可能会导致根结构的削弱[4]，并增加牙根骨折的风险[5]。

微创牙髓学(MIE)最近被引入，可用于通过保存组织和造成最小损伤来预防或治疗疾病[6]。有人建议在预备根管时使用较小锥度的器械，以保留更多的牙质和减少压力，主要是对正在进行根管治疗的冠状三分之一的牙齿[7，8]。然而，我们也知道，灌溉微小扩大的管道也可能带来额外的缺点，如灌溉渗透有限，针楔，气锁效应，以及与声波/超声/根尖负压灌溉相关的挑战[9]。当使用小锥度的器械时，主要的问题是它们清洁和塑造根管的能力。因此，在根管消毒过程中，寻找一种更有效的根管清洁器械是非常重要的。

光子诱导光声流(PIPS)是一种新型激光搅拌技术。在这项技术中，激光的基础是在低设置下激光的照相力学效应相关的腔内流体中产生空化现象和声流[10]。PIPS与其他技术的不同之处在于，工作头尖端被放置在根管的冠状部分，避免了对根管壁和根尖周组织的热损伤。我们之前的研究报道PIPS联合2% NaOCl对直根管模型有很强的杀菌作用[11]。在本研究中，我们使用腺苷5'-三磷酸(ATP)检测试剂盒、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和扫描电子显微镜(SEM)评估了NaOCl与PIPS在不同宽度和锥度的根管中的杀菌效果。试验的原假设是，增加根管的锥度和直径对提高灌洗液的除菌能力没有积极影响。

样本的选择

该研究得到了广州医科大学口腔医学院伦理委员会的批准。先前的研究[12]用于确定计算本研究总样本量所需的效应量为0.50。输入α型误差= 0.05，幂(1−β) = 0.80 (F检验族，ANOVA, G* power for Windows)。每组最少使用10颗牙齿。3组为阳性对照组。因此，我们选择了23颗拔除的上颌第一磨牙，它们有三个独立的牙根，在牙科显微镜下没有可见的牙根龋、裂纹或牙根吸收(Zumax，苏州，中国)。这些牙齿是从中国人群中提取的，超声清洗并在无菌盐水溶液中保存不超过48小时。

根管预备

在处理之前，使用高速金刚石毛刺去除部分冠，使每个标本的工作长度保持在19毫米。应用日本SHOFC公司的Beautifil Flow Plus F00封闭根尖孔。打开牙髓腔，在显微镜下检查以确定根管孔。近端颊根管(MB)、下颚根管(DB)和腭根管(P)预备至#10/。02 # 25 /。02和#25/.06respectively.

在#10/。2组用10号/.02预备根管K-file (Dentsply，瑞士)。它的大小与工作长度一致，并使用一个相互作用，直到它松动地适合运河。在#25/。02组，DB根管采用#25/.02预备k文件。# 10 / 02使用K-file，然后是#15/.02k文件,# 20 / 02 K-file, and #25/.02 K-file until it fit loosely in the canal. In the #25/.06 group, the P root canal was prepared using MTWO rotary files (VDW, Munich, Germany) and an electric motor (VDW). The following files were used: #10/.04, #15/.05, #20/.06, and #25/.06. The instrument was used to the full length of the canals (a single-length technique) with a gentle in-and-out motion until the working length was reached.

每个锉只用于放大一条管。根管预备全部由一名操作人员完成。

根管的细菌接种

粪肠球菌(ATCC 29212)在脑心灌注(BHI)肉汤(Hopebio，青岛，中国)中培养。单个菌落接种5 mL BHI，在37℃的好氧室中接种24 h。A 5 × 10⁸制备CFU/mL悬浮液，相当于0.5 McFarland。然后在根管系统中加入200 μL的细菌悬液。标本在37°C下孵育4周，每24小时更新一次菌悬液。孵育后，用1 mL蒸馏水冲洗根管。随机选取三颗感染的牙齿作为对照组，不进行治疗。剩下的20颗牙齿被分为两组。无菌纸尖插入根管系统，静置1 min，收集浮游细菌。使用单独的Eppendorf管收集每根管的样本(S0样本)。在灌根管前，随机选取3个感染样本，分别用ATP测定试剂盒和CLSM测定ATP值和死菌百分比。

根管灌溉

10例标本采用常规针灌(CNI)。在10号根管口下方3mm处放置30号灌溉侧通气针尖。在工作长度在#25/ 02组。02和#25/。06年组。无尖与根管壁接触。用3 mL 2% NaOCl冲洗根管60 s。

对10个标本进行PIPS。灌溉尖端在髓腔中保持静止，并在上述循环中被激活，同时确保在整个灌溉过程中，管腔和髓腔始终被动地充满灌溉液。用2940 nm Er YAG激光(AT Fidelis;Fotona，卢布尔雅那，斯洛文尼亚)配备了带有400 μm直径石英尖端(XPulse 400/14, Fotona)的手机(R14-PIPS, Fotona)。尖端按制造商的建议，以0.3 W, 15 Hz, 20 mJ /脉冲的速度施加，没有水/空气喷雾[13]。将纤维尖端置于髓腔内。用3 mL 2% NaOCl激活根管灌溉30 s。

CNI或PIPS后，用1ml蒸馏水冲洗所有样品，以清除根管中残留的冲洗液。然后用无菌纸点和Eppendorf管采集S1样本。以上工序均由牙髓科一位经验丰富的单一操作人员完成。每个锉刀用于准备一个根管系统。

ATP检测试剂盒分析

根管系统中ATP的测定与先前的报道相同[14]根据制造商说明使用ATP检测试剂盒(Beyotime, China, S0026)。每个细菌样本都是在灌洗前(S0)和灌洗后(S1)依次放置无菌纸点在根管中收集的。将纸点置于根管内1 min，获得细菌样本，然后转移到1.5 ml Eppendorf管中，管中含有200 μL裂解缓冲液和0.025 g玻璃微珠(D3350-01, Omega Biotek Inc.，美国)，4℃下以12000 g/min离心5 min，收集上清液。制备ATP检测溶液。将ATP检测液(20 μL)和稀释后的80 μL溶液混合在检测管中，室温孵育5 min。然后将20 μL样品加入ATP检测液中，用ATP荧光检测仪(Lux-T020, China)定量。

样品形貌分析

通过CLSM分析区分根管壁和牙本质小管上的活菌和非活菌。用高速金刚石毛刺在根表面雕刻纵向凹槽，不进入根管内部。然后用凿子将牙齿分成两部分，放入1毫升的试管中。然后，根据制造商的说明，将一半的根表面暴露在活/死BacLight细菌活力试剂盒(L7012, Life, USA)的试剂中15分钟。通过标记距离根尖孔0 - 3,3 - 6,6 - 9mm的根来建立根尖、中、冠状三分之一。使用CLSM (Carl Zeiss, Germany)用20 ×物镜检测根管壁和牙本质小管上是否存在绿色生物膜(活的)或红色生物膜(死的)。每个扫描区域的生物膜图像步长为10 μm，扫描总面积为100 μm，得到10层。使用Zen Black软件(Carl Zeiss, Germany)对每一层进行三维重建。

扫描电镜分析

进行扫描电镜分析，以确定根管断面是否存在细菌感染和牙本质小管内的细菌渗透。未进行CLSM分析的其余一半根表面在2.5%戊二醛中固定24小时，在上升乙腈系列中脱水(50%、70%、80%、90%和100%，各两次，每次20分钟)，在室温下干燥，溅射铂(离子溅射E-1045;日立)，并用扫描电镜(S-4800;日立)。

统计分析

所有统计分析均使用SPSS 17.0版统计软件(IBM SPSS Inc，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行。评估数据分布的正态性。正态分布数据以均值和标准差(SD)表示，并使用单向方差分析(ANOVA)进行比较。统计显著性设为P< 0.05。

根管灌溉前，各组间ATP值和死菌百分比无统计学差异(P> 0．05）.图中显示了整个管道的ATP中位数。1，冠状区、中间区和根尖区死菌百分比中位数如图所示。2，3.,4,分别。CNI或PIPS灌洗后所有组冠状、中间和根尖三分之一的代表性扫描电镜图像如图所示。5而且6,分别。

ATP分析

在CNI组和PIPS组中，灌水后ATP值均有降低，但PIPS组的ATP降低幅度更大。PIPS后，10号尺寸的ATP减少了98.36%±0.21%。2根管，25号根管占98.56%±0.43%。2根管，25号根管径增加99.18%±0.25%。牙根管。ATP的大小减少#10/。02根管数PIPS组明显大于CNI组(91.79%±1.85%)(P< 0．05)．

样品形貌分析

在CNI组中，根管尺寸为#10/的根管内细菌死亡比例最高。02，然后是#25/。02和#25/.06（P< 0．05）.在PIPS组，根管尺寸为#25/。02号根管的死菌比例明显高于10号根管。所有三个地区的02 (P< 0．05)．根管尺寸#25/。与25号/.06号根管相比，02号根管的死亡细菌比例明显更高（P< 0．冠状区和中间区大小差异无统计学意义(0.05)。

在#10/中，死亡细菌的百分比明显更高。与25例相比，有02例根管接受PIPS治疗。3个部位均行CNI的根管6个(P< 0．05）.

扫描电子显微镜

在冠状区PIPS激活的根管系统中观察到开放的牙本质小管。其他部位根本质上可见涂片层和碎屑。

MIE最近引起了临床医生的关注。作为MIE的重要组成部分，保存牙齿硬组织被认为是增加根管治疗牙齿长期成功的实用方法[15]。因此，在根管的机械化学制备过程中，消毒尤为重要。

生物膜内的细菌对抗菌剂和抗生素的耐药性是浮游细菌(自由生活的)的10倍到1000倍，而且还能够有效地逃避免疫系统[16]。本离体研究采用单物种生物膜模型粪大肠，这是一种革兰氏阳性微生物，常见于无症状的持续性牙髓感染。该微生物以浮游细菌的形式存在于根管生物膜中[17]。浮游细菌可以附着在根管壁上形成生物膜，生物膜也可以分离形成浮游细菌[18]。生物膜被定义为高度有组织的结构，由细菌组成，包围在附着于表面的自我产生的细胞外基质中[19]。

结果表明，PIPS对灌溉后根管内浮游细菌和生物膜内细菌的杀灭效果优于CNI。这与之前的研究结果一致[20.，21]。多和高丹[22]对59项与PIPS相关的研究进行了回顾，并确定18项研究涉及管道消毒。这些研究中有三分之二(11/18)得出结论，PIPS对细菌的杀灭效果明显优于CNI。更大的杀菌效果可能归因于PIPS中使用的激光能量，它表现出所有激光中最高的水和羟基磷灰石吸附性，导致贯穿根管的三维搅拌流体[23]。激光激活是通过空化实现的，在光纤尖端形成膨胀和坍塌的蒸汽泡[10]。这些巨大的椭圆气泡在100到200µs后内爆，诱导二次空化效应，清除根管系统中的浮游细菌和生物膜[24]。

25/中预备后根管的容积。06明显大于#10/。02和#25/.02。培养基体积越大，细菌生长越快。粪大肠培养21天后可在根管内形成稳定的生物膜模型[25]。三个独立的根可以保证每个根管中没有交流的分支，这会影响细菌的培养和冲洗效果，但相同的培养条件可以保证培养21天后每个根管中形成的生物膜的一致性。根管灌溉前，各组间ATP值和死菌百分比无统计学差异(P> 0．05）.

CNI后，#10/肛内细菌死亡比例最高。02根管，其次是#25/。02和#25/.06。这可能是因为使用CNI + 1% NaOCl时，根管容积越大，根管内灌洗液越多，更有利于灌洗液置换，杀菌效果更好。我们的结果与以往的研究一致[26，27]。更深的灌洗渗透是可取的，因为一些离体实验表明CNI只允许NaOCl渗入根牙质250微米[28]。因此，在CLSM上观察到大量的绿色活菌。

在PIPS组中，当锥度为0.02时，在所有三个区域，25号根管的死菌比例都高于10号根管。ATP在#10/。02和#25/。根管减少98%以上．这些结果表明，当使用相同的锥度时，将根管宽度从10号扩大到25号可以提高根管中pip的杀菌效果。

既往研究报道大锥度器械对根管冠状区和根管中部有较好的清创术效果[29，30.]。在本研究中，当根管宽度为#25时，使用PIPS时，冠状区和中间区锥度为0.02的根管与锥度为0.06的根管之间没有显著差异。在根尖区，#25/。02根管的死菌率明显高于#25/。pip后的根管。这些结果表明，增大根管锥度对2% NaOCl的PIPS去除生物膜没有积极影响。彼得斯和莫杜托[31]报道了在根管冠状区使用PIPS激光尖端可将冲洗液驱动至根管末端，且对根尖组织无不良影响。因此，在不增大根尖锥度和不损伤根尖周组织的情况下，PIPS可以达到更好的清洁效果，具有临床意义。

在这三个地区，#10/。经历PIPS的02根管死菌率明显高于#25/。6例根管CNI。这些结果表明，在锥度和宽度较小的根管中，PIPS的杀菌效果优于CNI。这可能是因为PIPS提高了灌洗液的更换速度，即使在根管系统中体积较小，也能有效地对根管进行消毒。程等人。[32]报道了15号根管NaOCl对PIPS的消毒效果与40号根管NaOCl的CNI相似(P> 0．05）.换句话说，与CNI相比，使用更小的宽度的PIPS达到了相同的消毒效果。制备锥度和宽度较小的根管可能有助于防止牙科组织的过度流失和保存根管治疗牙齿的结构完整性，并且可能是一种有前途的MIE手术[33，34，35，36]。因此，原假设被拒绝。

PIPS组死菌率最高的是冠状区，其次是中间区和根尖区。扫描电镜成像显示发生pip的根管系统冠状区牙本质小管开放。其他部位根本质上可见涂片层和碎屑。这可能是由于我们在根管预备时没有添加乙二胺四乙酸(EDTA)来去除涂抹层。在PIPS组中，观察到冠状牙本质小管是开放的，说明PIPS能够去除细菌生物膜和涂抹层。蒋等。[37]报道了PIPS尖端只放置在标本的冠状区域，其光声激波可能在距离到根尖区域的距离上减弱;因此，PIPS去除根尖区细菌生物膜的效果不如冠状区。我们的结果与之前的研究一致。

本研究的局限性在于粪大肠单独评价会过于简化生物膜模型，单物种生物膜与多物种生物膜存在较大差异。尽管以往研究中使用的方法存在差异，但大多数结果表明PIPS是根管预备过程中有效的杀菌方法。我们的研究结果清楚地表明，PIPS显著提高了抗微生物作用粪大肠体外浮游细菌和生物膜。在这项研究中，PIPS通过将激光尖端插入根管的冠状三分之一来工作，对较小的根管系统比CNI更有效。这些结果表明PIPS可能是一种极有前途的激光在牙髓学中的应用。

当使用相同的锥度时，增加根管宽度可以提高pip的杀菌效果。增加锥度对25号根管中PIPS的抗菌效果没有积极影响。在锥度和宽度较小的根管中，PIPS的杀菌效果更好。PIPS有效地清洁了涂抹层，打开了根管冠状区域的牙本质小管。

原始数据可由作者提供给任何希望与我们合作的研究人员。

pip值:

光子引发的光声流

有限公司:

常规针灌

ATP:

腺苷5 '三磷酸

嗨:

脑心灌注

不适用。

本工作得到广州医科大学资助(批准号:[2017]-210和[2017]-160)。资金来自蒋前洲。

作者指出

1. 程文和梁燕对这项工作做出了同样的贡献

从属关系

1. 广州医科大学附属口腔医院牙髓科，广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广东广州510182

   文程，闫亮，孔媛媛，赵健，李杨，蒋倩舟

贡献

QJ对研究的概念和设计做出了贡献;CW和LY完成了大部分实验;JZ、YK和YL进行数据分析。所有作者都参与了手稿的起草和对草案的关键修改。所有作者都已阅读并批准了最终版本的手稿。

相应的作者

对应到洲江．

伦理批准并同意参与

不适用于目前的体外研究。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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