利用噬菌体裂解酶控制致病菌

我们的实验室已经开发出噬菌体溶解酶，通过特异性地破坏粘膜和血液中的疾病细菌来防止感染。特定的酶肺炎链球菌和链球菌已开发用于鼻腔和口腔，以控制医院和疗养院等环境中的这些微生物，以预防或显著减少这些病原体造成的严重感染。此外,一个炭疽杆菌一种特殊的酶被开发出来杀死受感染个体血液中这些细菌的营养形态。在动物研究中，>80%的经粘膜定植或静脉感染致病菌的小鼠在同一定植或感染部位经单酶处理后，非定植或存活。

噬菌体感染宿主细菌以产生更多的病毒颗粒。在繁殖周期(可能持续一个小时)结束时，它们面临一个问题，如何释放困在细菌内的子代噬菌体[1]．他们通过产生一种叫做溶酶的酶来解决这个问题，溶酶能降解被感染细菌的细胞壁，释放出子代噬菌体。裂解体系由一个孔组成[1以及至少一种能降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶或溶酶。细胞溶解酶可以endo-beta-N-acetyl-glucosaminidases或N-acetylmuramidases(溶菌酶)作用于糖基,肽链内切酶,作用于肽横桥,或更常见的,一个N-acetylmuramoyl-L-alanine酰胺酶(或酰胺酶),水解酰胺键连接的糖和多肽半个。典型地，holin在噬菌体感染的后期表达，在细胞膜上形成一个孔，允许预先形成的溶酶(s)进入细胞壁肽聚糖，导致子噬菌体的释放。值得注意的是，外源性添加的溶解素可以溶解健康的、未感染的细胞的细胞壁，产生一种称为“裂解”的现象。然而，由于缺乏外膜，这种现象只在革兰氏阳性菌中观察到。

而溶酶素已经被发现很多年了[2- - - - - -5我们的实验室是第一个将这些酶用于治疗和预防的实验室在活的有机体内在它们的纯化形式，以杀死在粘膜表面和血液中的定植致病菌。我们已经成功地使用这种酶来杀死链球菌［6，7最近，炭疽杆菌［8]．所有这些酶都是高度进化的分子，专为特定目的而设计，用来快速摧毁细菌的细胞壁，因此，我们发现每毫升的酶，纳克到亚微克的量，就足以使10⁷细菌悬浮液在几秒钟内。到目前为止，除了化学药剂，还没有已知的生物化合物能如此迅速地杀死细菌。这种噬菌体裂解酶是噬菌体及其与细菌结合数百万年发展的产物。由于几乎所有的细菌都是或可以被噬菌体感染的，因此几乎所有致病细菌都可能产生这种酶。然而，这些酶似乎对革兰氏阳性细菌最有效。在这些生物体中，当外源性添加时，酶能够快速进入肽聚糖中的键。在革兰氏阴性细菌中，外膜是这些酶的屏障。

酶结构

迄今为止，噬菌体裂解酶的特征是其结构域[9，10]．一般情况下，n端结构域包含酶的催化活性，如前所述，酶会裂解细菌细胞壁肽聚糖的四个主要键之一[1]。在迄今报道的噬菌体裂解酶中，绝大多数是酰胺酶。噬菌体裂解酶的C端结构域对细胞壁底物具有特异性[11- - - - - -14]．因此，除非结合结构域与壁底物结合，否则催化结构域不会裂解，这为大多数研究的酶提供了特异性。起初，这种特异性的原因并不明显，因为噬菌体会专门设计一种对宿主致命的酶，这似乎违反了直觉。然而，随着我们对这些酶的功能了解的更多，这种特异性的可能原因变得明显(见下文，对酶的抗性)。

作用方式

通过噬菌体酶处理细菌的薄片电子显微镜观察，似乎这些酶通过消化局部区域的肽聚糖，在细胞壁上形成孔洞来发挥其致死作用。由于细菌内部的渗透压与正常外部环境相比约为3个大气压，因此会导致细胞质膜挤出，最终导致低渗溶解。自从Loessner发现了它[14]由于这些酶与免疫球蛋白分子具有亲和力，因此它们本质上是一种单用酶，需要多个分子来完成消化细胞壁的工作。关于这些分子为何以这种方式进化的一种解释是，裂解后与壁基质的紧密结合将限制酶分子的运动，阻止附近潜在噬菌体宿主的裂解。

有针对性的杀戮

这些酶的一个有趣的特点是，它们能杀死产生它们的细菌。例如，链球菌噬菌体产生的酶可以杀死细菌链球菌和肺炎球菌噬菌体产生的酶杀死肺炎双球菌［6，7]．具体来说，C组链球菌溶血素会杀死A组链球菌链球菌对C组和G组的影响较小链球菌，但对正常的口腔基本上没有影响链球菌．肺炎球菌特异性溶酶也有类似的结果。然而在这种情况下，这种酶也被用来对抗肺炎双球菌对青霉素有抗药性，杀灭效果相同。与抗生素不同的是，抗生素通常是广谱的，可以杀死人体内发现的许多不同的细菌，其中一些是有益的，而噬菌体酶只能杀死疾病细菌，对正常的人体菌群几乎没有影响。因此，噬菌体赖氨酸是一种能够靶向杀死病原菌的分子，对周围正常菌群几乎没有影响。当在两个动物模型系统（一个粘膜系统和另一个皮肤系统）中测试A组链球菌酶的安全性时，每天向这些表面添加酶，持续7天，并对组织进行目视和组织学检查，未观察到任何异常。这并不奇怪，因为噬菌体酶切割的键只在细菌中发现，而不是在人体组织中发现。因此，预计这些酶在人体内将具有良好的耐受性。

体内实验

两个在活的有机体内建立了粘膜定殖的动物模型，以测试溶菌素杀灭这些表面生物的能力。建立A组口腔定植模型链球菌，并开发了一个鼻腔模型肺炎双球菌［6，7]．在这两种情况下，当动物被各自的细菌定植并用少量特定于定植有机体的溶酶处理时，动物被发现在溶酶处理后2到5小时内没有定植细菌。在A组链球菌实验中，也在溶酶治疗24和48小时后拭子动物。在这段时间里，大多数动物对链球菌，但有一只动物死亡，另外两只显示阳性菌落。我们将这些结果解释为阳性动物在定殖的前四天被感染，在那里一些生物变成了细胞内。因此，虽然溶酶能够清除表面发现的生物体，但它不能杀死引发感染的生物体。我们排除了在24和48小时出现的微生物出现的可能性，因为它们对溶血素产生了抗性，通过检查它们对溶血素的敏感性。

控制炭疽

因为噬菌体酶在杀死致病菌方面非常有效，它们可能是控制生物战细菌的有用工具。为了确定该方法的可行性，我们从噬菌体中鉴定了一种特异性的裂解酶炭疽杆菌［15]．在使用-噬菌体DNA的克隆实验中，我们在噬菌体基因组中鉴定了一个约700 bp的ORF编码一个26 kDa的产物，该产物在大小和特征上与多种噬菌体非常相似芽孢杆菌和李斯特菌噬菌体细胞溶解酶。然后用两步离子交换色谱法纯化γ溶酶，并测试其对γ噬菌体敏感的致死作用杆菌.接触三秒钟后，只要10微克PlyG，a~10的活菌数就会减少5000倍⁷芽孢杆菌文化(8]在生长培养基、磷酸盐缓冲液甚至人类血液中都观察到这种致命活性。当这种酶对五个突变体进行测试时炭疽杆菌菌株和十种不同的毒性炭疽杆菌在世界范围内分离的菌株，被发现对所有人都是致命的。虽然普利g对炭疽杆菌我们发现，在60C短时间热激后加入萌发剂l -丙氨酸，使孢子迅速萌发，此时酶迅速致死。

10岁时⁷蜡样芽胞杆菌RSVF的近亲炭疽杆菌)被腹腔注射给15只老鼠，所有的老鼠都在4小时内死于迅速致命的败血症。当两组小鼠(n = 8和n = 17)同时接受IP挑战时杆菌15分钟后，分别给予150 μg和50 μg PlyG，存活率为70% ~ 80%。我们预计，高剂量或多剂量的酶将产生近100%的保护。在一个单独的实验中，两组小鼠被给予124 cfu的炭疽杆菌静脉注射Ames菌株，15分钟后，一组注射PlyG，另一组注射缓冲液。当随访12天时，接受酶治疗的小鼠存活率为90%，而对照组小鼠存活率仅为10%。因此，我们预计这种方法可能被用于暴露后的炭疽病例，在这种病例中，个体将被静脉注射PlyG以控制炭疽杆菌在萌芽后进入血液。这种策略可能会扩大抗生素治疗的窗口，并允许先天免疫系统清除任何残留杆菌．

耐酶

反复暴露于琼脂平板上生长的细菌的低浓度溶酶并不能导致耐药菌株的恢复，在暴露于液体中低浓度酶的几个周期后，我们也不能识别出耐药细菌[7]．这可能是由于肺炎球菌溶血素的细胞壁受体是胆碱[16，这是肺炎球菌生存所必需的分子。对A组链球菌，我们发现细菌的细胞壁成分多鼠李糖是赖氨酸结合所必需的（Nelson和Fischetti，未发表）虽然尚未得到证实，但在噬菌体与细菌的数千年的结合过程中，为了避免被困在宿主细胞内，它们的裂解酶的结合域可能已经进化为针对细胞壁中一个独特且重要的分子m对这些酶产生耐药性是罕见的事件。

对酶的免疫反应

因为酶是蛋白质，当通过粘膜或系统传递这些分子时，可以预期免疫反应，导致酶活性的中和。为了验证这一点，我们对家兔进行了PlyG酶的超免疫，并用ELISA法检测产生的抗体。我们发现，在免疫的两只兔子中，两种抗血清的抗体效价均为> 25000(最高血清稀释度的倒数，30分钟OD值为1.0)。用未稀释(或稀释)的抗血清或免疫前血清1:1稀释PlyG并检测其裂解活性时，免疫血清和免疫前血清的裂解活性无差异。因此，抗体不具有灭活PlyG的能力，这表明它可能被长期或长期使用。这似乎不是单独的PlyG溶酶的一个特征，因为类似的结果被观察到针对cpl1酶的抗体肺炎双球菌［17]．

噬菌体酶具有广泛的应用前景。每当需要杀死细菌，并且可以与生物体接触时，噬菌体酶就可以自由地利用。它们不仅可用于控制人体粘膜上的致病菌，还可在食品工业中用于控制致病细菌。因为耐药细菌在医院、日托中心和疗养院的严重问题葡萄球菌和肺炎双球菌在这些环境中，这些酶可能会立即发挥作用。因此，我们可以在我们的设备中添加噬菌体酶来对抗致病菌。它们是由噬菌体在与细菌的斗争中发展了数百万年的分子。他们还没有被利用。

我要感谢我的实验室成员，他们负责我在这篇综述中描述的大部分工作，Qi Chang, Mattias Collin, Jutta Loeffler, Daniel Nelson, Raymond Schuch和Pauline young，并在Ryann Russell, Mary Windels和Shiwei Zhu的出色技术帮助下。由美国国防高级研究计划局(DARPA)资助。

隶属关系

1. 洛克菲勒大学，纽约，纽约，10021，美国

   文森特体能训练时一个Fischetti这样

通讯作者

给文森特·菲舍蒂的信件。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

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