口腔抗菌肽与龋病的生物防治

唾液中抗菌肽(AMPs)的存在可能是导致龋病易感性或耐龋的生物因素。本文将回顾唾液中的抗菌肽，考虑它们的抗菌和免疫调节功能，并评估它们在口腔保护牙齿表面和口腔黏膜中的潜在作用。这些amp在唾液腺和导管细胞中产生，具有广泛的抗菌活性。中性粒细胞也会将α防御素和LL37释放到龈沟液中。这两种来源都可以解释它们在唾液中的存在。最近一项针对中学生的研究旨在确定儿童龋齿患病率与唾液中抗微生物肽人类β -防御素-3 (hBD-3)、抗菌肽LL37和α -防御素浓度之间的可能相关性。这些amp的水平在人群中是高度可变的。虽然LL37和hBD-3水平与患龋经历无关，但无龋儿童的α防御素水平显著高于患龋儿童(p < 0.005)。我们得出结论，几种类型的amp可能对口腔健康有作用，存在于未刺激的唾液。唾液中α -防御素的低水平可能是导致龋齿易感性的生物学因素。 Our observation could lead to new ways to prevent caries and to a new tool for caries risk assessment.

口腔是一个独特的环境。口腔黏膜是外部和内部环境之间的一个重要的保护界面，必须作为一个屏障，以防止口腔中存在的无数微生物物种。唾液、上皮表面层和多形核白细胞(中性粒细胞)均以重叠但独立的方式维持口腔和牙周组织的健康(图)1）.抗菌肽(AMPs)是一种天然抗生素，存在于唾液、上皮细胞和中性粒细胞中。越来越多的证据表明，amp作为宿主先天免疫反应的一部分，是维持健康与疾病之间平衡的重要贡献者。它们通常被认为有助于黏膜健康;然而，合乎逻辑的是，这些amp是影响龋病易感性和发展的生物因素。

图示:唾液(蓝色)、牙龈上皮(粉红色)和通过龈沟液进入口腔的中性粒细胞(PMNs)中存在抗菌肽。所有这些来源的抗菌肽可能有助于保护黏膜免受细菌感染和牙齿表面免受龋病。

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本手稿将审查口头安培，将其作为基因遗传因素的作用，这些因素可能是影响龋齿风险的生物控制，简要描述了对有龋齿和没有龋齿的儿童的安培研究，并讨论了一个特定放大器在龋齿中的潜在效用风险评估和预防。

口服抗菌肽提供了抵御多种病原体的第一道防线[1-3.］．三个主要的AMP家庭的成员在口腔中发现。这些由生物化学和结构特征定义：1）没有半胱氨酸的α-螺旋肽（Cathelicidin，LL37）[4.];2）具有三个二硫键的肽（α-和β-浸敏）[1那5.];3)特定氨基酸比例异常高的肽;例如，组蛋白[6.］．

最近的研究表明防御素和抗菌肽LL37作为口腔中的抗菌剂的重要性[7.，而组蛋白主要是抗真菌药物[6.］．人β-防御素(hBDs)广泛表达于口腔组织，包括牙龈上皮[8.那9.]、唾液腺及导管及唾液[10.那11.］．中性粒细胞防御素(human neutrophil peptide 1-3 (HNP1-3))是非氧化性微生物杀伤机制之一[5.]，并在龈沟液中发现[12.］．人抗菌肽LL37存在于中性粒细胞、炎症上皮、下颌下唾液腺和唾液中[13.那14.］．

随着抗菌肽现在强烈参与宿主先天免疫反应，特别是在口腔(由Dale和Fredericks, Ganz综述)[7.那1，它们在未受刺激的唾液中的可用性暗示了它们在保护牙齿结构免受细菌引起的龋齿方面的潜在作用，无论是通过直接杀死牙齿，还是通过防止牙齿表面生物膜的形成。

防御素和抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广泛的抗菌活性，对STreptococcus mutans，porphyromonas gingivalis和放线杆菌actinomycetemcomitans［7.那15.-19.］．表中总结了AMPs在唾液中的表达及主要活性1；然而，值得注意的是，由于未知的原因，这些多肽具有物种和菌株的特异性，很难概括它们的抗菌功能。抗菌肽和防御素可与其他抗菌素协同作用[20.那21.］．因此，LL37和防御素在唾液中与组织蛋白、富含脯氨酸的蛋白和钙卫蛋白等多肽共同表达，可能提供一种天然的抗生素屏障。

AMPs在唾液中的表达量因个体而异。这已经在-和-防御素、组蛋白和富含脯氨酸的蛋白质中得到证实[6.那22.那23.］．我们对儿童的初步研究表明，即使考虑总唾液蛋白质的差异（见下文），个体之间，这些肽在未刺激的唾液中的水平也很大。口腔组织中唾液中和它们的mRNA中浓度的浓度的大变化可能归因于组织它们的基因。α-和β-防御素的基因位于人染色体8上的簇中。该区域中的几个基因可以作为多重重复拷贝发生。这被称为拷贝数多态性[24.那25.］．我们还不知道拥有多个特定基因副本的个体，例如HNP1，是否会制造更多的这种蛋白质，但这似乎很有可能。换句话说，-和-防御素数量的个体差异可能是由基因决定的。相比之下，LL37基因只有一个副本，位于3号染色体上。

也有证据表明，遗传因素决定了龋齿的易感性。坊间证据表明，即使在同一个家庭中，孩子患龋的经历也存在个体差异[26］．这些个体差异表明，可能由基因决定的生物因素在抗龋和易感性方面发挥着作用。对双胞胎的研究提供了迄今为止最有力的证据，证明生物遗传因素对龋齿易感性的重要性[27-29］．同卵双胞胎(MZ，同卵双胞胎)比异卵双胞胎(DZ，异卵双胞胎)在患龋经验方面表现出更大的相似性(Shuler综述)[30.］．

唾液成分可能是影响龋病风险的生物因素。唾液中的许多蛋白质成分，如富含脯氨酸的糖蛋白、粘蛋白、免疫球蛋白、凝集素、乳铁蛋白、半胱抑素和溶菌酶被认为在口腔中的防御中起作用[31］．许多研究研究了这些唾液蛋白和糖蛋白和龋齿经验之间的相关性，但没有研究单一唾液组分和龋齿经验之间的可靠关联[32那33］．AMPs在唾液和整个口腔的表达表明，它们可能在保护牙齿结构免受龋齿以及保护口腔黏膜方面发挥作用。该提案的几个原因是1）安培具有广泛的抗微生物活动;2）他们的行动与唾液中的其他抗微生物增量;Cathelicidins和Defensins的共表达，如组织蛋白，富含脯氨酸，富含植物蛋白的蛋白质可以增强抗微生物功能;3）它们刺激了所获得的免疫系统，可以起到增强IgA生产以及IgG生产的作用[2];4)这些抗菌肽的作用可能是控制细菌总数，并帮助防止生物膜的形成。因此，口服抗菌肽可能提供天然的抗生素屏障。

为了调查唾液中AMP水平与龋齿经验之间可能的关系，我们在华盛顿州农村地区的中学儿童中进行了一项研究[34］．149名儿童(88名女性，61名男性)参与了这项研究。所有的孩子年龄都在11到15岁之间。大多数人口是西班牙裔，也有一些美洲原住民和白种人。研究对象的父母完成了简短的健康史调查。口腔检查由经过训练的、校准的临床医生使用标准化程序进行。总的来说，92%的儿童健康，没有重大疾病或疾病史。根据华盛顿大学机构审查委员会(University of Washington Institutional Review Board)批准的协议，这项研究得到了学校官员的许可，研究对象和家长通过教育会议获得了知情同意，并获得了书面双语同意。采集了简要的健康史，收集了未刺激的唾液样本，并将其冷冻保存以备以后分析。检查人员被要求分别对受试者的活性龋和填充物表面进行排名，分别为0，无龋或填充物表面; 1, mild (1–2 affected surfaces); 2, moderate (3–6 affected surfaces); and 3, severe (>6 affected surfaces). Final caries experience score was determined as the sum of the scores for active decay and filled surfaces. Fifty-three subjects (36%) had no decay, 37 (24%), 39 (27%), and 20 (13%) had caries scores of 1, 2, and 3 or greater, respectively.

对于分析，通过以15,000rpm离心两次，将唾液样品进行解冻并清除10分钟。通过BCA测定（Pierce Inc.，Rockford，IL，USA）和根据制造商的指示（Hycecl Biotechnology，Uden，Netherlands），测定通过BCA测定（Pierce Inc.，Rockford，IL，USA）和α-Defensin HNP1-3 ELISA测定的总蛋白质浓度的清除唾液样品。该测定法测量HNP1,2和3，因为抗体不区分这些密切相关的肽。通过使用来自Orbigen Inc，San Diego，Ca的多克隆抗体的鸟类药物，Belmont，Ca和HBD3，通过槽免疫印迹分析（LL37通过来自Orbigen Inc，San Diego，CA）的槽免疫印迹分析（LL37，通过来自Orbigen Inc，San Diego，Ca）的槽免疫印迹分析（LL37，通过来自orbigen Inc，San Diego，CA）的蛋白抗体分析（LL37的测定的酸提取物用于测定LL37和HBD3。未刺激的唾液样品的平均蛋白质浓度为1633±908μg/ ml（范围为401至7052μg/ ml）。该值与此前报告此年龄组的总蛋白质浓度同意[35］．唾液蛋白浓度与年龄、性别、龋病评分无相关性。抗菌肽(AMP)浓度在μg/ml范围内。AMP水平也被归一化为每个样本全唾液中的蛋白质浓度。HNP1-3、hBD3和LL37在我们的人群中都显示出广泛的浓度变化，即使是标准化到唾液总蛋白水平。HNP1-3、hBD3和LL37的平均值分别为0.94、0.73、3.36 μg/ml，范围比平均值上下扩大10倍。儿童未受刺激唾液中AMPs的浓度以前没有报道，尽管正常成年人的平均值为0.8 μg/ml HNP [36］．

当评估AMP表达和龋齿经验的关系时，我们发现不同龋齿组中HNP1-3水平的显着差异（P <0.005）。对于相对于唾液蛋白（μg/ mg）的唾液HNP1-3浓度（μg/ ml）和唾液HNP1-3的平均（或中位数）水平观察到差异。对于所有受试者，HNP1-3浓度为1.30±0.22μg/ ml（中位±STD。误差是平均值的平均值），所有受试者的龋齿为0.73±0.07μg/ ml（n = 92）（独立样品两尾T试验，P = 0.005）。相对于总唾液蛋白的HNP1-3值为0.84±0.14μg/ mg蛋白在龋齿组中，组合龋基团中的0.48±0.05μg/ mg蛋白质（p = 0.005）（图2）.对LL37的相似分析显示，无龋组的LL37水平高于有龋组，但结果没有统计学意义。唾液中HBD3浓度和HBD3相对于蛋白的水平在我们的人群中或在不同龋病组之间没有显著差异(未显示)。统计分析还使用基于秩的Kruskal-Wallis非参数检验，并为非正态分布数据设计。通过这个测试，显著性差异得到了验证甚至改善。我们还评估了与龋齿的关联是否可能是由于要么HNP1-3要么LL37，但超过90％的效果是由于HNP1-3。

Saliva的HNP 1-3浓度作为龋齿分数的函数。HNP1-3肽密切相关，并通过使用的免疫测定检测。注意龋齿组和0龋基团之间的统计学意义;* P <0.05;*** p <0.005。

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最后，为了进一步研究HNP1-3与龋齿的关系，我们将HNP浓度值分为四分位数，并对无龋齿和有龋齿的受试者进行评估(表)2）.随着HNP浓度的增加，越来越大的受试者没有龋齿;只有14％的受试者的HNP1-3水平<0.4μg/ ml（n = 36）是无龋的，但55％的受试者的HNP1-3水平大于1.08μg/ ml（n = 36）是龋齿自由。可以很容易地看到，唾液α-防御素的儿童具有更大水平的龋齿。

我们的研究有两个主要发现。首先，个体间AMP水平存在很大差异;即使对唾液总蛋白进行了调整，其水平也从最低到最高变化了100倍。第二，α防御素HNP1-3水平与龋病呈负相关(图)2）.我们的研究结果表明，低唾液水平的HNP1-3可能有助于龋齿易感性，并可能是一种新的和有用的衡量龋齿风险的儿童。

唾液amp最明显的来源是唾液腺和导管细胞的分泌。LL-37和-防御素在唾液腺中表达[7.那8.那10.那13.那14.］．此外，我们通过免疫组织化学在下颌唾液腺导管细胞中发现了HNP1-3 [34］．颌下腺是未刺激唾液的主要来源，提示这些细胞可能是唾液中amp的来源。然而，HNP1-3和LL37的另一个重要来源是中性粒细胞，它们通过龈沟液进入口腔。据估计，在正常个体中，每分钟有30,000个中性粒细胞通过牙齿周围的交界上皮进入口腔[37］．牙周健康需要这种嗜中性粒细胞的流动，中性粒细胞功能和嗜疗症的缺陷与儿童早期发病牙周病有关[38那39］．我们的研究结果表明，中性粒细胞的流动对防止龋齿也很重要。

唾液中的HNP1-3可以通过直接的抗菌特性(单独或与唾液中的其他成分结合)或通过其结合细菌外膜的能力防止牙齿表面生物膜的形成，从而有助于抵抗龋齿。在这项研究中，唾液中发现的AMP水平在β -防御素和β -防御素的有效抗菌功能范围内。S. Mutans.［17.虽然海地国家警察对S. Mutans.尚未报道。唾液中的低离子强度有利于抗菌活性，从而可能影响口腔菌群，对口腔健康产生有益的影响。此外，-和-防御素以及LL37具有其他免疫调节和化学引诱作用，高表达的个体可能受益于这些作用。HNP1-3与龋病经验呈负相关，提示其可能具有保护作用。相反，低水平的HNP1-3可能导致龋齿易感性增加。

我们有很多后续问题。基于我们的研究设计,我们还不能确定唾液alpha-defensin水平是预测未来的龋齿,但我们已经表明,儿童龋齿大大降低alpha-defensins都基于他们的唾液浓度和总唾液蛋白的关系。这一发现能否在年幼的儿童中得到证实?这一点很重要，因为在预防措施可能产生最大影响的时候，需要采用新的方法对幼儿进行龋齿风险评估。确定患病风险最高的儿童将使有限的资源能够用于个性化、积极和主动的预防龋齿干预措施。随着时间的推移，amp的水平是否可以复制?α -防御素是否可以用于治疗或前瞻性的漱口水、牙膏或口香糖?这种作用主要是一种抗菌作用，还是由于这些肽的免疫调节功能?α -防御素水平很低的儿童与α -防御素水平高的儿童有不同的菌群吗?刷牙的强度和唾液中amp的水平有关系吗? Perhaps vigorous brushing could stimulate outflow of the neutrophils via the gingival sulcus. In addition, the junctional epithelium is innervated with substance P expressing nerve fibers. Irritation provoked by vigorous brushing might stimulate local release of this neuropeptide, which in turn has profound chemoattractive activity for neutrophils [40那41］．

龋齿风险的预测一直是人们长期关注的问题，对于制定新的预防策略非常重要。这对幼儿和有特殊保健需要的儿童尤其重要。唾液是一种很容易获得的液体，可以非侵入性地收集，并用于测量和监测龋齿的风险[42］．HNP1-3的分析是容易执行的，可以做不到0.2毫升的粗全唾液。唾液α -防御素(HNP1-3)水平低可能是一种新的和有用的衡量龋齿风险的儿童。未来的研究可能导致提高内源性口腔多肽表达的手段的发展，利用这些多肽作为治疗手段，并开发一种简单的检测龋齿风险的临床评估。

这项研究是由国家牙科和颅面研究所通过西北/阿拉斯加减少口腔健康差异研究中心(U54 DE14254)资助的。

从属关系

1. 华盛顿大学口腔生物学系，华盛顿州西雅图357132号邮编:98195

   贝弗利戴尔和珍妮特r金球

2. 广西医科大学，广西南宁

   Renchuan道

3. 伊利诺伊大学在芝加哥，芝加哥，伊利诺伊州伊利诺伊大学口头诊断部

   理查德J Jurevic

相应的作者

对应到贝弗莉一个戴尔。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

所有作者阅读并认可的终稿。

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